É grande a preocupação na identificação de compostos envolvidos no desenvolvimento de processos deletérios, como o câncer. O tetraidrofurano (THF) é um solvente amplamente utilizado em indústria e pesquisa e estudos recentes indicaram uma atividade carcinogênica em animais experimentais, incentivando a investigação da sua possível interação com biomoléculas. Adutos de DNA servem como marcadores para a identificação da atividade genotóxica de substâncias e para o monitoramento da exposição humana aos agentes genotóxicos. Estudos realizados in vitro, em células em cultura, bem como em animais experimentais, permitem que mecanismos sejam desvendados e metodologias sejam desenvolvidas para uma posterior avaliação da exposição humana. O contínuo desenvolvimento de técnicas de análise de adutos em DNA para monitoramento biológico constitui importante preocupação para pesquisadores envolvidos com a saúde ocupacional e a medicina preventiva. No presente trabalho foi investigada a reação de produtos de oxidação do THF com os nucleosídeos 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd). As estruturas dos adutos formados foram elucidadas por análises de espectros de massas (ESI/MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) após purificação de quantidade suficiente dos produtos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Com isso, foi aberta a possibilidade de validação de novos marcadores de exposição a THF. Tais lesões foram detectadas em DNA incubado com THF oxidado in vitro, após o desenvolvimento de uma metodologia sensível e seletiva baseada em HPLC/ESI/MS-MS. Além disso, camundongos foram expostos a vapor de THF e foi feita análise de dano oxidativo (8-oxo-2-desoxiguanosina) no DNA de fígado e rim. Um aumento de aproximadamente oito vezes no nível de 8-oxo-2-desoxiguanosina foi observado no DNA dos órgãos dos camundongos expostos ao THF. Nossos estudos in vitro apontam para a possibilidade de ação genotóxica do THF oxidado (formação de adutos com o DNA). A ocorrência dessa via in vivo será investigada em estudos posteriores. Adicionalmente, há aumento de dano oxidativo em órgãos alvos de carcinogênese induzida por esse solvente. / There is a huge concern to identify compounds involved in the development of harmful processes, like cancer. Tetrahydrofuran (THF) is a solvent widely used in industries and recent researches and studies indicated a carcinogenic activity in experimental animals, instigating the investigation of its possible interaction with biomolecules. DNA adducts are used as markers for the identification of genotoxic activity of substances and monitoring the human exposition to genotoxic agents. Studies carried out in vitro, in culture cells and in experimental animals allow to disclose mechanisms and develop methodologies for a posterior evaluation of the human exposition. The continuous development of techniques for the analysis of DNA adducts for biological monitoring constitutes a remarkable concern for the researchers involved with occupational health and preventive medicine. In the present paper, the reaction of THF oxidation products with the nucleosides 2\'-deoxyadenosine (dAdo) and 2\'-deoxycitidine (dCyd) were investigated. The structures of the formed adducts were elucidated by mass spectra analysis (ESI/MS-MS) and nuclear magnetic resonance (RMN) after purification of sufficient quantities of the products by high-performance liquid chromatography (HPLC). Thus, the validation of new markers of exposition to THF was made possible. Such damages were detected in DNA incubated with oxidized THF in vitro, after the development of a sensible and selective methodology based on HPLC/ESI/MS-MS. Moreover, mice were exposed to THF vapors and an oxidative damage analysis (8-oxo-2\'-deoxyguanosine) was carried out on DNA from liver and kidney. An approximate 8-fold increase in the level of 8-oxo-2\'-deoxyguanosine was observed on DNA from the mices organs exposed to THF. Our in vitro studies indicate the possibility of oxidized THF genotoxic action (formation of adducts with DNA). The occurrence of this path in vivo will be investigated in future studies. In addition, the oxidative damage in target organs of carcinogenesis induced by this solvent was increased.

É grande a preocupação na identificação de compostos envolvidos no desenvolvimento de processos deletérios, como o câncer. O tetraidrofurano (THF) é um solvente amplamente utilizado em indústria e pesquisa e estudos recentes indicaram uma atividade carcinogênica em animais experimentais, incentivando a investigação da sua possível interação com biomoléculas. Adutos de DNA servem como marcadores para a identificação da atividade genotóxica de substâncias e para o monitoramento da exposição humana aos agentes genotóxicos. Estudos realizados in vitro, em células em cultura, bem como em animais experimentais, permitem que mecanismos sejam desvendados e metodologias sejam desenvolvidas para uma posterior avaliação da exposição humana. O contínuo desenvolvimento de técnicas de análise de adutos em DNA para monitoramento biológico constitui importante preocupação para pesquisadores envolvidos com a saúde ocupacional e a medicina preventiva. No presente trabalho foi investigada a reação de produtos de oxidação do THF com os nucleosídeos 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd). As estruturas dos adutos formados foram elucidadas por análises de espectros de massas (ESI/MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) após purificação de quantidade suficiente dos produtos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Com isso, foi aberta a possibilidade de validação de novos marcadores de exposição a THF. Tais lesões foram detectadas em DNA incubado com THF oxidado in vitro, após o desenvolvimento de uma metodologia sensível e seletiva baseada em HPLC/ESI/MS-MS. Além disso, camundongos foram expostos a vapor de THF e foi feita análise de dano oxidativo (8-oxo-2-desoxiguanosina) no DNA de fígado e rim. Um aumento de aproximadamente oito vezes no nível de 8-oxo-2-desoxiguanosina foi observado no DNA dos órgãos dos camundongos expostos ao THF. Nossos estudos in vitro apontam para a possibilidade de ação genotóxica do THF oxidado (formação de adutos com o DNA). A ocorrência dessa via in vivo será investigada em estudos posteriores. Adicionalmente, há aumento de dano oxidativo em órgãos alvos de carcinogênese induzida por esse solvente. / There is a huge concern to identify compounds involved in the development of harmful processes, like cancer. Tetrahydrofuran (THF) is a solvent widely used in industries and recent researches and studies indicated a carcinogenic activity in experimental animals, instigating the investigation of its possible interaction with biomolecules. DNA adducts are used as markers for the identification of genotoxic activity of substances and monitoring the human exposition to genotoxic agents. Studies carried out in vitro, in culture cells and in experimental animals allow to disclose mechanisms and develop methodologies for a posterior evaluation of the human exposition. The continuous development of techniques for the analysis of DNA adducts for biological monitoring constitutes a remarkable concern for the researchers involved with occupational health and preventive medicine. In the present paper, the reaction of THF oxidation products with the nucleosides 2\'-deoxyadenosine (dAdo) and 2\'-deoxycitidine (dCyd) were investigated. The structures of the formed adducts were elucidated by mass spectra analysis (ESI/MS-MS) and nuclear magnetic resonance (RMN) after purification of sufficient quantities of the products by high-performance liquid chromatography (HPLC). Thus, the validation of new markers of exposition to THF was made possible. Such damages were detected in DNA incubated with oxidized THF in vitro, after the development of a sensible and selective methodology based on HPLC/ESI/MS-MS. Moreover, mice were exposed to THF vapors and an oxidative damage analysis (8-oxo-2\'-deoxyguanosine) was carried out on DNA from liver and kidney. An approximate 8-fold increase in the level of 8-oxo-2\'-deoxyguanosine was observed on DNA from the mices organs exposed to THF. Our in vitro studies indicate the possibility of oxidized THF genotoxic action (formation of adducts with DNA). The occurrence of this path in vivo will be investigated in future studies. In addition, the oxidative damage in target organs of carcinogenesis induced by this solvent was increased.

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Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-12-14T17:45:59Z No. of bitstreams: 1 Elica Santos Rios.pdf: 736943 bytes, checksum: 973f89d16d74c3e4d0210b33228d1a9c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-14T17:45:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elica Santos Rios.pdf: 736943 bytes, checksum: 973f89d16d74c3e4d0210b33228d1a9c (MD5) Previous issue date: 2013-02-19 / The palm is recognized as a major forage resources for animal production in the semiarid. However, in recent years, most of palmais North East began to be compromised by the cochineal carmine (Dactylopius opuntiae Cockerell), being necessary control measures that are efficient and that do not affect the activity of the microbiota present in the soil. Thus, the present study aimed to evaluate the effect of xenobiotics applied in the culture of palm infested by D. opuntiae on natural enemies encountered in culture and soil microbes. The study was conducted in an area with palm cv. gigantic (Opuntia ficus-indica) scale-infested cochineal carmine in the region of Caétes – PE. The experimental design was a randomized block with 5 treatments: control (water), detergent + bleach, oil neem, methomyl and thiamethoxam lambda-cyhalothrin, and 3 repetitions. Before application of xenobiotics were conducted eight data collections, to observe the growth of the population of cochineal carmine and distribution of natural enemies. After application of the products, three samples were conducted to quantify the efficiency of xenobiotics and their effect on natural enemies and soil microbes by respirometry microbial, bacterial count and genetic variability of bacteria. For this, were collected soils (0-20cm), the respirometry assessed by monitoring the release of CO2 by the microorganisms for a period of 30 days. In microbiology, was evaluated population density of the bacteria after 24, 48 and 72h of incubation, morphological variability and by staining. Subsequently, we assessed the genetic variability, by molecular techniques, using BOX-PCR. There was increase in the number of colonies of cochineal carmine even after application of xenobiotics, which are not significantly affected natural enemies (IN) present in the culture, as these insects occurred even at low densities, independent of the application of the products. The predatory species of cochineal carmine were observed Zagreus bimaculosus, Cybocephalus sp. and larvae Salpingogaster cochenillivorus, and Z. bimaculosus, considered the most frequent. As to respirometry, there is, in relative terms, the amount of CO2 released from the soil samples was higher in the plots with the application of the insecticide thiamethoxam + lambda-cyhalothrin, relative to the control, not differing from other treatments. Soils treated with water alone (control) and detergent + bleachshowed the largest populations (0.96 and 0.94 x 102 UFC.g-1, respectively). It was observed that soils with water application (control) and detergent + bleach, showed bacteria with slower growth, and the other treatments, with accelerated growth occurred 24h, decreasing from 48 h of incubation. In morphological characteristic (coloration) bacterial colonies predominated white colonies, demonstrating visually low genetic variability. However, the application of molecular techniques (BOX-PCR), revealed high genetic variability between colonies of white coloration analyzed. Demonstrating that given the importance of cactus for semiarid region is of great importance more detailed studies on the effects of xenobiotics on the microbiota and associated insects. / A palma é reconhecida como um dos principais recursos forrageiros para a produção animal no semiárido. Entretanto, nos últimos anos, grande parte dos palmais do Nordeste passaram a ser comprometidos pela cochonilha do carmim (Dactylopius opuntiae Cockerell), sendo necessárias medidas de controle que sejam eficientes e que não afetem a atividade da microbiota presente no solo. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos xenobióticos aplicados na cultura da palma infestada por D. opuntiae sobre os inimigos naturais encontrados na cultura e na microbiota do solo. A pesquisa foi conduzida numa área com palma cv. gigante (Opuntia ficus-indica) infestada pela cochonilha do carmim na região de Caetés - PE. O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com 5 tratamentos: controle (água); detergente + água sanitária; óleo de nim; metomil e tiametoxam lambda-cialotrina, e 3 repetições. Antes da aplicação dos xenobióticos foram realizadas 8 coletas de dados, para observar o crescimento da população da cochonilha do carmim e distribuição dos inimigos naturais. Após a aplicação dos produtos, foram realizadas 3 coletas para quantificar a eficiência dos xenobióticos e seu efeito sobre os inimigos naturais e a microbiota do solo, através da respirometria microbiana, quantificação bacteriana e variabilidade genética de bactérias. Para isso, foram coletados solos (0-20cm), sendo a respirometria avaliada monitorando-se a liberação de CO2 pelos micro-organismos, por um período de 30 dias. Na microbiologia, foi avaliada a densidade populacional das bactérias, após 24, 48 e 72h de incubação, e a variabilidade morfológica, através da coloração. Posteriormente, avaliou-se a variabilidade genética, através de técnicas moleculares, utilizando-se BOX-PCR. Houve aumento do número de colônias da cochonilha do carmim mesmo após a aplicação dos xenobióticos, os quais também não afetaram de maneira significativa os inimigos naturais (IN) presentes na cultura, já que estes insetos ocorreram, mesmo que em baixas densidades, independente da aplicação dos produtos. As espécies predadoras da cochonilha do carmim observadas foram Zagreus bimaculosus, Cybocephalus sp. e larvas de Salpingogaster cochenillivorus, sendo Z. bimaculosus, considerado a mais frequente. Quanto à respirometria, verifica-se, em termos relativos, que a quantidade de CO2 liberado nas amostras de solo foi maior nas parcelas com a aplicação do inseticida tiametoxam+lambda-cialotrina, em relação ao controle, não diferindo dos demais tratamentos. Os solos tratados com apenas água (controle) e detergente + água sanitária apresentaram as maiores populações (0,96 e 0,94 x 102 UFC.g-1, respectivamente). Observou-se que solos com aplicação de água (controle) e detergente + água sanitária, apresentaram bactérias com crescimento mais lento, e nos demais tratamentos, ocorreram crescimento mais acelerado com 24h, diminuindo a partir de 48h de incubação. Na característica morfológica (coloração), as colônias bacterianas houve predomínio de colônias brancas, demostrando visualmente baixa variabilidade genética. Entretanto, a aplicação da técnica molecular (BOX-PCR), revelou alta variabilidade genética entre as colônias de coloração brancas analisadas. Demostrando que diante da importância da palma forrageira para o semiárido é de suma importância estudos mais detalhados sobre os efeitos dos xenobióticos sobre a microbiota e os insetos associados.

O consumo de álcool vem sendo associado a um aumento do risco de câncer e a uma situação de estresse oxidativo. Os metabólitos responsáveis por tais processos permanecem em discussão. Neste trabalho, caracterizamos novos metabólitos radicalares do etanol e examinamos suas interações com ácidos nucléicos. Primeiramente, demonstramos que os radicais 1-hidroxietila e 2-hidroxietila produzidos durante a oxidação do etanol por sistemas Fenton alquilam DNA e RNA in vitro produzindo os adutos 8-(1-HE)Gua e 8-(2-HE)Gua, respectivamente. Esses adutos foram sintetizados e caracterizados quimicamente. Também, demonstramos que acetaldeído, o principal metabólito do etanol, é oxidado por sistemas Fenton, peroxinitrito, xantina oxidase, partículas submitocondriais e ratos a radicais acetila e metila. Esses radicais foram caracterizados e seus mecanismos de formação elucidados, pelo menos in vitro. A possibilidade do radical 1-hidroxietila alquilar ácidos nucléicos in vivo foi também examinada. Inesperadamente, o aduto 8-(1-HE)Gua foi detectado em RNA e DNA do fígado de ratos controle e seus níveis não foram significativamente alterados após administração aguda de etanol. Esses resultados sugerem que os radicais 1-hidroxietila, acetila e metila são importantes metabólitos do etanol in vivo mas atacam preferencialmente outras biomoléculas que não ácidos nucléicos. / Alcohol consumption has been associated with increased cancer risk and an oxidative stress condition. Ethanol metabolites responsible for these processes remain debatable. Here, we characterized novel radical metabolites of ethanol and examined their interactions with nucleic acids. First, we demonstrated that the 1-hydroxyethyl and 2-hydroxyethyl radical produced from ethanol oxidation by Fenton systems alkylated DNA and RNA in vitro to produce 8-(1HE)Gua and 8-(2-HE)Gua, respectively. Both adducts were synthesized and structurally characterized. Next, we demonstrated that acetaldehyde, the main ethanol metabolite, is oxidized by Fenton systems, peroxynitrite, xanthine oxidase, submitochondrial particles and whole rats to acetyl and methyl radicals. These radicals were characterized and their production mechanisms in vitro elucidated. The possibility of the 1-hydroxyethyl radical alkylating nucleic acids in vivo was also examined. Unexpectedly, the adduct 8-(1-HE)Gua was detected in RNA and DNA from liver of control rats and their levels were not increased by acute ethanol treatment. Overall, the results suggest that the radicals 1-hydroxyethyl, acetyl and methyl are important ethanol metabolites in vivo but they preferentially attack biomolecules other than nucleic acids.

A fumaça do cigarro é composta por mais de 4.700 substâncias, muitas das quais tóxicas. O sistema nervoso central (SNC) possui poucas defesas antioxidantes, além de ser rico em lipídeos facilmente oxidáveis e de conter alto teor de metais de transição envolvidos na formação de radicais livres. Existem evidências de que a fumaça do cigarro causa alterações nas enzimas antioxidantes em roedores adultos, mas pouco se sabe sobre os efeitos do tabaco no SNC ainda em desenvolvimento. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os possíveis efeitos da fumaça do cigarro no SNC de camundongos jovens. Camundongos BALB/c foram expostos a uma mistura de fumaça central e lateral do cigarro (Souza Cruz - Derby Vermelho) dentro de uma câmara de polipropileno acoplada a um sistema Venturi. Além da exposição aguda, realizada no 18º dia de vida, os animais foram expostos a partir do 5º dia de vida por 13 ou 35 dias, durante 2 horas por dia, 7 dias por semana. Os animais foram então eutanasiados por deslocamento cervical imediatamente ou três horas após a última exposição e foram realizadas as determinações das atividades enzimáticas da glutationa peroxidase, glutationa redutase, glutationa S-transferase, além da quantificação de malonaldeído (MDA) e 3-nitrotirosina no cerebelo, córtex frontal, estriado, hipocampo e hipotálamo. Nossos resultados indicam que o SNC em desenvolvimento é susceptível à fumaça do cigarro. Foram detectadas alterações nas enzimas antioxidantes em diferentes estruturas encefálicas imediatamente após a última exposição sugerindo diferença de sensibilidade das diferentes áreas à fumaça do cigarro. Contudo, essas perturbações não são persistentes, uma vez que a maior parte delas desapareceu três horas após a exposição. O cerebelo parece ser a estrutura mais resistente enquanto o córtex frontal e o estriado, as mais sensíveis. No córtex frontal as alterações enzimáticas são mais persistentes e houve aumento de MDA no grupo agudo e eutanásia 3 horas após a exposição, enquanto no cerebelo, estriado e hipocampo houve aumento de MDA no grupo agudo e eutanásia imediatamente após a exposição. Esses resultados sugerem uma resposta mais tardia do córtex frontal e uma possível adaptação dos tecidos ao xenobiótico. É importante destacar que a eutanásia realizada imediatamente após a exposição crônica à fumaça do cigarro não reflete somente o efeito da última exposição, já que tanto o padrão encontrado na alteração das enzimas quanto na determinação de MDA foi diferente do observado após exposição aguda. / Cigarette\'s smoke is composed of more than 4.700 substances, many of them are toxic. The central nervous system (CNS) has few antioxidant defenses, is rich in easily oxidable lipids and contains high levels of transition metals which are involved in the formation of free radicals. There are evidences that tobacco smoke causes changes in the antioxidant enzymes in adult rodents, but little is known about its effects during CNS development. Thus, the aim of this work was to evaluate the possible effects of cigarettes smoke in the CNS of young mice. BALB/c mice were exposed to a mixture of mainstream and sidestream smoke of cigarette (Souza Cruz Red Derby) in a polypropylene chamber attached to a Venturi system. Besides acute exposure, performed at the 18th day of life, the animals were exposed from the 5th day of life for 13 or 35 days, 2 hours a day, 7 days in a week. The animals were then euthanized by cervical dislocation, immediately or three hours after the last exposure. The determinations of enzymatic activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glutathione S-transferase, and the quantification of malonaldehyde (MDA) and 3-nitrotyrosine in cerebellum, frontal cortex, striatum, hippocampus and hypothalamus were performed. Our results indicate that the CNS in development is susceptible to cigarettes smoke. Alterations in antioxidant enzymes in different brain structures were detected immediately after the last exposure suggesting differences in sensitivity of different areas to cigarette\'s smoke. However, these disturbances are not persistent, as most of them disappeared three hours after exposure. Cerebellum seems to be the more resistant structure, while frontal cortex and striatum the most sensitive. Enzyme changes in frontal cortex were more persistent and there was an increase of MDA only in the acute group and euthanasia 3 hours after exposure, whereas in cerebellum, striatum and hippocampus, MDA increased only in acute group and immediately euthanasia after exposure. These results suggest a delayed response of the frontal cortex and a possible adaptation of tissues to xenobiotics. It is important to point out that euthanasia performed immediately after chronic exposure to cigarette smoke not only reflect the effect of the last exposure, since the pattern found in the modification of enzymes and in the determination of MDA was different from that observed after acute exposure.

Neste trabalho, foram analisados alguns sistemas bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em diferentes tecidos de moluscos bivalves, em resposta a diferentes tipos de estresse ambiental, com o intuito de se verificar a possibilidade de utilização destes sistemas em programas de biomonitoramento do ambiente marinho, assim como verificar a influência de variações em parâmetros ambientais não relacionados à poluição sobre esses sistemas. Mexilhões Perna perna e Mytella guyanensis coletados em ambientes poluídos apresentaram níveis significativamente maiores de lesões em DNA e lipídeos que animais coletados em local limpo. Além disso, mexilhões expostos a metais apresentaram também maiores níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados indicam que as lesões analisadas nos mexilhões apresentaram uma boa resposta aos diferentes contaminantes, o que sugere sua utilização como biomarcadores da contaminação ambiental marinha. Entretanto, outros fatores tais como os ciclos de exposição ao ar, sazonalidade e variações de salinidade também ocasionaram oscilações nos níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados sugerem que deve-se ter especial atenção às condições de coleta em estudos de biomonitormanento ambiental, uma vez que variações ambientais não controladas em fatores abióticos podem influenciar nos resultados obtidos Em mexilhões expostos a diferentes metais em laboratório por diferentes períodos, foram estudadas as atividades de algumas enzimas antioxidantes tais como a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa peroxidase específica para hidroperóxidos de lipídeos (PHGPx), glutationa S-transferase (GST), níveis de glutationa reduzida (GSH) e de peroxidação lipídica. Algumas oscilações foram observadas nestes parâmetros, em relação à susceptibilidade dos tecidos à peroxidação lipídica. As maiores correlações foram observadas entre a atividade da PHGPx e os níveis de peroxidação lipídica, indicando um possível papel protetor da PHGPx contra lesões oxidativas às membranas, como também sua modulação pelos metais. Níveis de serotonina (5HT) e dopamina (DOPA) foram também avaliados em glândulas digestivas e tecido muscular de mexilhões P. perna, onde verificou-se que os metais causaram depleção dos níveis de 5HT e DOPA. No caso específico de tecidos musculares, uma diminuição dos níveis destes dois compostos poderia ser devido à contração tônica das valvas dos mexilhões em resposta a presença dos metais, uma vez que estes dois compostos estão envolvidos no relaxamento muscular dos mexilhões. Quando mexilhões foram expostos ao ar, constatamos também uma diminuição nos níveis de 5HT e DOPA no músculo, o que provavelmente estava associado à contração muscular para o fechamento das valvas, evitando assim a dessecação. Ao serem re-submersos, os níveis voltaram aos anteriores (similares aos controles), o que indicaria o relaxamento dos músculos com a conseqüente abertura das valvas. Nenhuma diferença foi observada nas glândulas digestivas. Pequenas variações foram também observadas nos níveis de 5HT e DOPA, entre mexilhões coletados em diferentes horários do dia, indicando o papel destes dois compostos no controle dos ritmos biológicos. Sendo assim, oscilações nos níveis destes dois compostos em função da exposição a metais pesados podem comprometer também os ritmos biológicos destes animais. Ainda, em estudos adicionais foi caracterizado por cromatografia líquida de alta performance acoplado à espectrometria de massas (HPLC/MS) e por ressonância magnética nuclear de próton e carbono, o produto de oxidação da melatonina pelo oxigênio singlete, o AFMK. Como parte deste estudo, comprovamos a hipótese de que a reação de nitrilas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino gera oxigênio singlete, em estudos de monitoramento das emissões de luz bi e monomoleculares do oxigênio singlete, e pela detecção do produto acetamida por HPLC/MS. Por fim, um novo método de detecção de melatonina e AFMK com alta especificidade e sensibilidade por HPLC/MS foi desenvolvido. / In this work, some biochemical systems were evaluated in different tissues of bivalve mollusks, in response to different stress, in order to verify the possibility of use of these systems as pollution bioindicators in marine environmental monitoring studies, as well as to verify the influence of environmental variations not related to pollution on these systems. Mussels Mytella guyanensis and Perna perna collected in polluted environments presented higher levels of DNA and lipid damage, compared to mussels from a reference site. Mussels exposed to different metals also presented high levels of DNA and lipid damage. These data indicates that the lesions evaluated in mussels showed good responses to the contaminants, suggesting its use as biomarkers of marine contamination. On the other hand, other environmental variations such as air exposure cyvles, seasonality and variations in salinity also caused changes in the levels of DNA and lipid damage, indicating that the collection procedure of mussels, including observations of the environment conditions, should be considered for better interpretation of the results. In mussels exposed to different metal at different time intervals, the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and glutathione S-transferase (GST), as well as the levels of reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation were evaluated. Some oscillations were observed in these parameters, related to the susceptibility of the digestive gland to lipid peroxidation. Major relationships were observed between the activity of PHGPx and the levels of lipid peroxidation, suggesting a protective role of PHGPx against lipid peroxidation and its modulation by metals. The levels of serotonin (5HT) and dopamine (DOPA) were also evaluated in digestive gland and muscle tissues of the mussels, being observed 5HT and DOPA depletion in both tissues. In muscle tissues, this would be related to the tonic catch contraction of muscle fibers in response to the metal exposure, since 5HT and DOPA are involved in this process. Experiments of exposure of mussels to air and re-submersion were also done to verify the effects on 5HT and DOPA levels. When mussels were exposed to air, decreases in 5HT and DOPA were observed, and when mussels were re-submersed, the levels back to the control values, which would also be related to the muscle contraction. No differences were observed in digestive glands. Little variations in 5HT and DOPA levels were observed between mussels collected at different times of the day, indicating a role of these compounds in the control of biological rithms. Additional studies were done, were the oxidative melatonin product by singlet molecular oxygen was characterized by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC/MS), and proton and carbon nuclear magnetic resonance. The chraracterized product was the kynurenine N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK). Along this study, the theory that the reaction of nitriles with hydrogen peroxide in alkaline solutions were confirmated through monitoring of the ligh emmited by singlet oxygen and the detection of the product formed (acetamide). Also, a new method for the simultaneous detection of melatonin and AFMK with high specificity and sensibility by HPLC/MS were developed.

Nesse trabalho enfatizamos o uso de marcadores bioquímicos de estresse oxidativo em microalgas como sinalizadores precoces de exposição a agentes xenobióticos. A curva de crescimento e a taxa de crescimento diário (µ) foram determinadas através do monitoramento in vivo da fluorescência da clorofila. Baseado nos protocolos de testes toxicológicos in vitro, usando microalgas expostas por 48h, determinou-se a concentração efetiva que inibiu 50% de µ (IC50). Culturas de M. polymorphus, com concentração inicial de 1 X 106 células.mL-1, foram submetidas separadamente ao IC50 de oxiflurfeno (OxF) e benzo[a]pireno (BaP) por 48h sendo, posteriormente, coletadas para a análise de cinética enzimática em espectrofotômetro. As análises tanto dos níveis de MDA como dos níveis de GSH/GSSG e Asc- foram feitas em HPLC usando detectores de fluorescência e detectores coulométricos flow-through respectivamente. Além disso, os ensaios sobre a excreção/liberação de H2O2 in vivo foram feitos em um luminômetro usando-se a técnica do luminol. Os valores de IC50 para o OxF e BaP foram de 0,24 µg.L-1 e 0,99 µg.L-1 respectivamente. Os resultados das análises enzimáticas, obtidos nos ensaios com OxF, ao serem comparadas com controles, mostram aumentos para SOD (150 ± 7 e 32 ± 6 USOD.mg.prot-1), seguidos por aumentos menores para CAT (6,5 ± 0,7 e 3,9 ± 0,5 U.mg.prot.-1) e APx (1,01 ± 0,06 e 0,82 ± 0,05 U.mg.prot.-1) respectivamente. Nas culturas expostas ao BaP os resultados, comparados ao controle, mostraram maior atividade de CAT (35,7 ± 1,3 e 4,0 ± 0,9 U.mg.prot.-1) e APx (4,95 ± 0,06 e 0,86 ± 0,03 U.mg.prot.-1) enquanto a SOD foi menos pronunciada (105 ± 6 e 35 ± 5 USOD.mg.prot.-1). As análises das enzimas GR e DHAR quando comparadas ao controle (0,78 ± 0,07 e 0,43 ± 0,08 U.mg.prot.-1 respectivamente) apresentaram-se inibidas em quase 50% quando sob a ação de OxF e não apresentaram variações na presença de BaP. As análises de GST comparadas aos controles, tiveram menor atividade nos grupos sob OxF (176 ± 28 e 73 ± 18 ) frente ao BaP (402 ± 67 e 71 ± 24). Os resultados em HPLC revelaram níveis de MDA elevados nos dois grupos, especificamente 9 e 5 vezes o valor dos controles para as amostras expostas ao OxF e ao BaP respectivamente. Os resultados de GSH mostram diminuição de GSHtotal frente aos controles, em quase 40% sob ação do OxF e mais de 50% nas culturas com BaP. Além disso, a percentagem de GSH na forma de GSSG comparada ao GSHtotal (%IR Índice redox) foi de 60 e 75% nos grupos com OxF e BaP respectivamente. Nos valores obtidos nas análises de Asc- os resultados apontam diminuição em 45% sob OxF e pouco mais de 15% na presença de BaP. As análises de excreção/liberação in vivo de H2O2 mostram acentuada liberação nas células expostas ao OxF quando comparadas ao tratamento com BaP. A observação dos valores de IC50, mostra uma maior toxicidade de OxF quando comparada ao BaP e os resultados das análises das enzimas antioxidantes nos revelam que M. polymorphus usa diferentes estratégias frente aos agentes tóxicos. Tendo em vista a inibição de CAT e APx, as células sob exposição ao OxF utilizam a eliminação direta de H2O2 no meio e, eliminação via ação da GST. No entanto, tal situação parece não diminuir os níveis de lipoperoxidação, mesmo com consumo excessivo de Asc. As culturas expostas ao BaP evitam a evolução de H2O2 via atividade enzimática preferencial e os níveis baixos de GSH denotam a utilização de GST em processos de conjugação de xenobióticos. / The use of biochemical oxidative stress biomarkers in microalgae, as early watches during xenobiotic exposure are emphasized. The growth curve and the diary cells population increase rate (µ) were determined by chlorophyll fluorescence in vivo monitoring. Applying toxicological in vitro tests protocols and using microalgae exposed for 48h, we have determined the effective concentration that provoked 50% of µ inhibition (IC50). M. polymorphus cultures in an initial cellular concentration of 1 X 106 cell.mL-1 were separately submitted to IC50 oxyfluorfen (OxF) and benzo[a]pyrene (BaP) during 48h and, after that, they were gathered to the kinetics enzymatic assay using spectrophotometer. The levels of MDA and the levels of GSH/GSSG plus Asc- were determined in the HPLC system coupling to the fluorescence and coulometric flow-through detectors, respectively. Additionally, in vivo H2O2 excretion/releasing assays were done using a luminometer associated to the luminol technique. The IC50 obtained in the OxF and BaP tests brought out the values 0.24 µ.L-1 and 0.99 µg.L-1 respectively. The results from the enzymatic analyses in the culture under OxF exposure, when compared to the controls, have shown increases in the SOD activities (150 ± 7 and 32 ± 6 USOD.mg.prot-1) followed by minor results to CAT (6.5 ± 0.7 and 3.9 ± 0.5 U.mg.prot.-1) and APx activities (1.01 ± 0.06 and 0.82 ± 0.05 U.mg.prot.-1), respectively. On the other hand, in cultures under BaP treatment, the results compared to the control have shown an increase of CAT (35.7 ± 1.3 and 4.0 ± 0.9 U.mg.prot.-1) and APx activities (4.95 ± 0.06 and 0.86 ± 0.03 U.mg.prot.-1) followed by minor SOD activities (105 ± 6 and 35 ± 5 USOD.mg.prot-1). The results from enzymatic analyses of GR and DHAR under OxF exposure presented around 50% of controls value (0.78 ± 0.07 and 0.43 ± 0.08 U.mg.prot.-1respectively). Contrarily, the culture under BaP treatment didnt show any variation compared to the controls. Instead, GST analyses - in the culture under OxF treatment - have shown minor activity (176 ± 28 and 73 ± 18) facing the cell cultures under BaP exposure (402 ± 67 and 71 ± 24), when compared to the controls. In the cultures under OxF and BaP treatment, HPLC analyses displayed an increase of 9 and 5 fold, respectively, in the MDA levels. The results of GSH in cultures under OxF have shown a decrease of 40% GSHtotal when compared to the control, and more than 50% in cultures under BaP treatment. In addition, the percentage of GSH in the GSSG form compared to GSHtotal (%RI Redox index) was 60 and 75% in the OxF and BaP groups, respectively. In the results obtained in analyses of Asc- there are a decrease of 45% in cultures under OxF and a little bit more than 15% in cultures under BaP treatment. The analyses of in vivo H2O2 excretion/releasing have shown pronounced freeing in the cell under OxF exposure when compared with BaP cultures. The results of IC50 value point to an increased toxicity in cells under OxF treatment in comparison to BaP cultures. On the other hand the results of antioxidant enzymes have shown us different strategies used by M. polymorphus facing the toxic agents. Having in mind the inhibition of CAT and APx, the cells under OxF exposure adopt the direct elimination of H2O2 in the culture medium and via GST activity. However, this situation seems not reduce the lipoperoxidation levels, not even, under the exceedingly Asc- consuming. Cultures exposed to BaP avoid H2O2 evolution de mainly via enzymatic activity and the lower levels of GSH pointing to the activity of GST during xenobiotic conjugation process.

A fumaça do cigarro é composta por mais de 4.700 substâncias, muitas das quais tóxicas. O sistema nervoso central (SNC) possui poucas defesas antioxidantes, além de ser rico em lipídeos facilmente oxidáveis e de conter alto teor de metais de transição envolvidos na formação de radicais livres. Existem evidências de que a fumaça do cigarro causa alterações nas enzimas antioxidantes em roedores adultos, mas pouco se sabe sobre os efeitos do tabaco no SNC ainda em desenvolvimento. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os possíveis efeitos da fumaça do cigarro no SNC de camundongos jovens. Camundongos BALB/c foram expostos a uma mistura de fumaça central e lateral do cigarro (Souza Cruz - Derby Vermelho) dentro de uma câmara de polipropileno acoplada a um sistema Venturi. Além da exposição aguda, realizada no 18º dia de vida, os animais foram expostos a partir do 5º dia de vida por 13 ou 35 dias, durante 2 horas por dia, 7 dias por semana. Os animais foram então eutanasiados por deslocamento cervical imediatamente ou três horas após a última exposição e foram realizadas as determinações das atividades enzimáticas da glutationa peroxidase, glutationa redutase, glutationa S-transferase, além da quantificação de malonaldeído (MDA) e 3-nitrotirosina no cerebelo, córtex frontal, estriado, hipocampo e hipotálamo. Nossos resultados indicam que o SNC em desenvolvimento é susceptível à fumaça do cigarro. Foram detectadas alterações nas enzimas antioxidantes em diferentes estruturas encefálicas imediatamente após a última exposição sugerindo diferença de sensibilidade das diferentes áreas à fumaça do cigarro. Contudo, essas perturbações não são persistentes, uma vez que a maior parte delas desapareceu três horas após a exposição. O cerebelo parece ser a estrutura mais resistente enquanto o córtex frontal e o estriado, as mais sensíveis. No córtex frontal as alterações enzimáticas são mais persistentes e houve aumento de MDA no grupo agudo e eutanásia 3 horas após a exposição, enquanto no cerebelo, estriado e hipocampo houve aumento de MDA no grupo agudo e eutanásia imediatamente após a exposição. Esses resultados sugerem uma resposta mais tardia do córtex frontal e uma possível adaptação dos tecidos ao xenobiótico. É importante destacar que a eutanásia realizada imediatamente após a exposição crônica à fumaça do cigarro não reflete somente o efeito da última exposição, já que tanto o padrão encontrado na alteração das enzimas quanto na determinação de MDA foi diferente do observado após exposição aguda. / Cigarette\'s smoke is composed of more than 4.700 substances, many of them are toxic. The central nervous system (CNS) has few antioxidant defenses, is rich in easily oxidable lipids and contains high levels of transition metals which are involved in the formation of free radicals. There are evidences that tobacco smoke causes changes in the antioxidant enzymes in adult rodents, but little is known about its effects during CNS development. Thus, the aim of this work was to evaluate the possible effects of cigarettes smoke in the CNS of young mice. BALB/c mice were exposed to a mixture of mainstream and sidestream smoke of cigarette (Souza Cruz Red Derby) in a polypropylene chamber attached to a Venturi system. Besides acute exposure, performed at the 18th day of life, the animals were exposed from the 5th day of life for 13 or 35 days, 2 hours a day, 7 days in a week. The animals were then euthanized by cervical dislocation, immediately or three hours after the last exposure. The determinations of enzymatic activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glutathione S-transferase, and the quantification of malonaldehyde (MDA) and 3-nitrotyrosine in cerebellum, frontal cortex, striatum, hippocampus and hypothalamus were performed. Our results indicate that the CNS in development is susceptible to cigarettes smoke. Alterations in antioxidant enzymes in different brain structures were detected immediately after the last exposure suggesting differences in sensitivity of different areas to cigarette\'s smoke. However, these disturbances are not persistent, as most of them disappeared three hours after exposure. Cerebellum seems to be the more resistant structure, while frontal cortex and striatum the most sensitive. Enzyme changes in frontal cortex were more persistent and there was an increase of MDA only in the acute group and euthanasia 3 hours after exposure, whereas in cerebellum, striatum and hippocampus, MDA increased only in acute group and immediately euthanasia after exposure. These results suggest a delayed response of the frontal cortex and a possible adaptation of tissues to xenobiotics. It is important to point out that euthanasia performed immediately after chronic exposure to cigarette smoke not only reflect the effect of the last exposure, since the pattern found in the modification of enzymes and in the determination of MDA was different from that observed after acute exposure.

Neste trabalho, foram analisados alguns sistemas bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em diferentes tecidos de moluscos bivalves, em resposta a diferentes tipos de estresse ambiental, com o intuito de se verificar a possibilidade de utilização destes sistemas em programas de biomonitoramento do ambiente marinho, assim como verificar a influência de variações em parâmetros ambientais não relacionados à poluição sobre esses sistemas. Mexilhões Perna perna e Mytella guyanensis coletados em ambientes poluídos apresentaram níveis significativamente maiores de lesões em DNA e lipídeos que animais coletados em local limpo. Além disso, mexilhões expostos a metais apresentaram também maiores níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados indicam que as lesões analisadas nos mexilhões apresentaram uma boa resposta aos diferentes contaminantes, o que sugere sua utilização como biomarcadores da contaminação ambiental marinha. Entretanto, outros fatores tais como os ciclos de exposição ao ar, sazonalidade e variações de salinidade também ocasionaram oscilações nos níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados sugerem que deve-se ter especial atenção às condições de coleta em estudos de biomonitormanento ambiental, uma vez que variações ambientais não controladas em fatores abióticos podem influenciar nos resultados obtidos Em mexilhões expostos a diferentes metais em laboratório por diferentes períodos, foram estudadas as atividades de algumas enzimas antioxidantes tais como a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa peroxidase específica para hidroperóxidos de lipídeos (PHGPx), glutationa S-transferase (GST), níveis de glutationa reduzida (GSH) e de peroxidação lipídica. Algumas oscilações foram observadas nestes parâmetros, em relação à susceptibilidade dos tecidos à peroxidação lipídica. As maiores correlações foram observadas entre a atividade da PHGPx e os níveis de peroxidação lipídica, indicando um possível papel protetor da PHGPx contra lesões oxidativas às membranas, como também sua modulação pelos metais. Níveis de serotonina (5HT) e dopamina (DOPA) foram também avaliados em glândulas digestivas e tecido muscular de mexilhões P. perna, onde verificou-se que os metais causaram depleção dos níveis de 5HT e DOPA. No caso específico de tecidos musculares, uma diminuição dos níveis destes dois compostos poderia ser devido à contração tônica das valvas dos mexilhões em resposta a presença dos metais, uma vez que estes dois compostos estão envolvidos no relaxamento muscular dos mexilhões. Quando mexilhões foram expostos ao ar, constatamos também uma diminuição nos níveis de 5HT e DOPA no músculo, o que provavelmente estava associado à contração muscular para o fechamento das valvas, evitando assim a dessecação. Ao serem re-submersos, os níveis voltaram aos anteriores (similares aos controles), o que indicaria o relaxamento dos músculos com a conseqüente abertura das valvas. Nenhuma diferença foi observada nas glândulas digestivas. Pequenas variações foram também observadas nos níveis de 5HT e DOPA, entre mexilhões coletados em diferentes horários do dia, indicando o papel destes dois compostos no controle dos ritmos biológicos. Sendo assim, oscilações nos níveis destes dois compostos em função da exposição a metais pesados podem comprometer também os ritmos biológicos destes animais. Ainda, em estudos adicionais foi caracterizado por cromatografia líquida de alta performance acoplado à espectrometria de massas (HPLC/MS) e por ressonância magnética nuclear de próton e carbono, o produto de oxidação da melatonina pelo oxigênio singlete, o AFMK. Como parte deste estudo, comprovamos a hipótese de que a reação de nitrilas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino gera oxigênio singlete, em estudos de monitoramento das emissões de luz bi e monomoleculares do oxigênio singlete, e pela detecção do produto acetamida por HPLC/MS. Por fim, um novo método de detecção de melatonina e AFMK com alta especificidade e sensibilidade por HPLC/MS foi desenvolvido. / In this work, some biochemical systems were evaluated in different tissues of bivalve mollusks, in response to different stress, in order to verify the possibility of use of these systems as pollution bioindicators in marine environmental monitoring studies, as well as to verify the influence of environmental variations not related to pollution on these systems. Mussels Mytella guyanensis and Perna perna collected in polluted environments presented higher levels of DNA and lipid damage, compared to mussels from a reference site. Mussels exposed to different metals also presented high levels of DNA and lipid damage. These data indicates that the lesions evaluated in mussels showed good responses to the contaminants, suggesting its use as biomarkers of marine contamination. On the other hand, other environmental variations such as air exposure cyvles, seasonality and variations in salinity also caused changes in the levels of DNA and lipid damage, indicating that the collection procedure of mussels, including observations of the environment conditions, should be considered for better interpretation of the results. In mussels exposed to different metal at different time intervals, the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and glutathione S-transferase (GST), as well as the levels of reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation were evaluated. Some oscillations were observed in these parameters, related to the susceptibility of the digestive gland to lipid peroxidation. Major relationships were observed between the activity of PHGPx and the levels of lipid peroxidation, suggesting a protective role of PHGPx against lipid peroxidation and its modulation by metals. The levels of serotonin (5HT) and dopamine (DOPA) were also evaluated in digestive gland and muscle tissues of the mussels, being observed 5HT and DOPA depletion in both tissues. In muscle tissues, this would be related to the tonic catch contraction of muscle fibers in response to the metal exposure, since 5HT and DOPA are involved in this process. Experiments of exposure of mussels to air and re-submersion were also done to verify the effects on 5HT and DOPA levels. When mussels were exposed to air, decreases in 5HT and DOPA were observed, and when mussels were re-submersed, the levels back to the control values, which would also be related to the muscle contraction. No differences were observed in digestive glands. Little variations in 5HT and DOPA levels were observed between mussels collected at different times of the day, indicating a role of these compounds in the control of biological rithms. Additional studies were done, were the oxidative melatonin product by singlet molecular oxygen was characterized by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC/MS), and proton and carbon nuclear magnetic resonance. The chraracterized product was the kynurenine N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK). Along this study, the theory that the reaction of nitriles with hydrogen peroxide in alkaline solutions were confirmated through monitoring of the ligh emmited by singlet oxygen and the detection of the product formed (acetamide). Also, a new method for the simultaneous detection of melatonin and AFMK with high specificity and sensibility by HPLC/MS were developed.