Para melhor entender o envolvimento do NER em lesões oxidativas averiguou-se os efeitos da foto-excitação do azul de metileno (MB) in vitro e in vivo. Verificou-se que MB e luz induzem muitos sítios sensíveis a enzima FPG em DNA plasmidial. Mostrou-se que MB é incorporado por fibroblastos humanos proficientes ou deficientes em NER (XP-A e XP-C) e gerou oxigênio singlete (1O2) intracelularmente. A foto-excitação do MB formou também 8-oxoG em núcleos de fibroblastos. Células mutantes XP-A e XP-C foram mais sensíveis ao tratamento e apresentaram mais danos oxidativos em seu DNA genômico do que células selvagens. Contudo, todas as células mostraram a mesma cinética de reparo das lesões formadas. Além disso, houve mais marcação de g-H2AX nas células mutantes após a foto-excitação do MB. Assim, os resultados sugerem que a excitação do MB gera danos oxidativos e quebras na molécula de DNA, tanto in vitro quanto in vivo e que as proteínas XPA e XPC podem ter algum papel na proteção desse estresse, além da sua sabida participação em reparo de lesões induzidas por luz UV. / In order to study the participation of NER mechanisms in the removal of oxidative DNA lesions, we examined the effects of photoactivated methylene blue (MB) in vitro and in vivo. Plasmid DNA presents more FPG sensitive sites when MB was photoactivated than non-photoactivated. MB can be incorporated by NER-proficient or deficient cells and is able to generate singlet oxygen (1O2) inside cells. We detected also the presence of 8-oxoG in genomic DNA after treatment. XP-A and XP-C deficient cells are more sensitive to MB treatment and were found to have more oxidative DNA lesions than proficient cells. Also, there are more g-H2AX foci in mutant cells after treatment. However, there is a clear similarity in lesions repair kinetic between proficient and deficient cells. Therefore, these results suggest that photoactivated MB generates oxidative damage and DNA strand breaks both vitro and in vivo assays and that XPA and XPC proteins may also have a role in the protection of cellular oxidative stress, in addition to its participation in repair of UV-induced DNA damage.

Para melhor entender o envolvimento do NER em lesões oxidativas averiguou-se os efeitos da foto-excitação do azul de metileno (MB) in vitro e in vivo. Verificou-se que MB e luz induzem muitos sítios sensíveis a enzima FPG em DNA plasmidial. Mostrou-se que MB é incorporado por fibroblastos humanos proficientes ou deficientes em NER (XP-A e XP-C) e gerou oxigênio singlete (1O2) intracelularmente. A foto-excitação do MB formou também 8-oxoG em núcleos de fibroblastos. Células mutantes XP-A e XP-C foram mais sensíveis ao tratamento e apresentaram mais danos oxidativos em seu DNA genômico do que células selvagens. Contudo, todas as células mostraram a mesma cinética de reparo das lesões formadas. Além disso, houve mais marcação de g-H2AX nas células mutantes após a foto-excitação do MB. Assim, os resultados sugerem que a excitação do MB gera danos oxidativos e quebras na molécula de DNA, tanto in vitro quanto in vivo e que as proteínas XPA e XPC podem ter algum papel na proteção desse estresse, além da sua sabida participação em reparo de lesões induzidas por luz UV. / In order to study the participation of NER mechanisms in the removal of oxidative DNA lesions, we examined the effects of photoactivated methylene blue (MB) in vitro and in vivo. Plasmid DNA presents more FPG sensitive sites when MB was photoactivated than non-photoactivated. MB can be incorporated by NER-proficient or deficient cells and is able to generate singlet oxygen (1O2) inside cells. We detected also the presence of 8-oxoG in genomic DNA after treatment. XP-A and XP-C deficient cells are more sensitive to MB treatment and were found to have more oxidative DNA lesions than proficient cells. Also, there are more g-H2AX foci in mutant cells after treatment. However, there is a clear similarity in lesions repair kinetic between proficient and deficient cells. Therefore, these results suggest that photoactivated MB generates oxidative damage and DNA strand breaks both vitro and in vivo assays and that XPA and XPC proteins may also have a role in the protection of cellular oxidative stress, in addition to its participation in repair of UV-induced DNA damage.

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno humano que tem preocupado a comunidade científica pelo aumento da resistência antimicrobiana. Os efeitos provocados pelos antimicrobianos podem levar à ativação de respostas mutagênicas que regulam polimerases de baixa fidelidade, atuando na Síntese Translesão de DNA (TLS). Neste trabalho, avaliamos a resposta de P. aeruginosa frente à Ceftazidima e Ciprofloxacina. Foi observado que Ceftazidima não induz a resposta SOS e mutagênese, diferentemente de Ciprofloxacina. Demonstramos que as três polimerases de TLS estão envolvidas na mutagênese induzida por Ciprofloxacina e peróxido de hidrogênio. Também, observamos que a perda de qualquer uma das polimerases alterou significativamente o espectro de mutações espontâneas e induzidas por Ciprofloxacina e que possuem funções redundantes neste processo mutagênico. Assim, demonstramos que as polimerases de TLS são importantes para a mutagênese induzida por Ciprofloxacina em P. aeruginosa, e podem estar implicadas na mutagênese adaptativa e, consequentemente, na resistência bacteriana. / Pseudomonas aeruginosa is a human pathogen that has worried the scientific community by increasing antimicrobial resistance. The effects caused by the antimicrobial agents may lead to the activation of mutagenic responses that regulate low fidelity polymerases, acting in DNA Transmission Synthesis (TLS). In this work, we evaluated the response of P. aeruginosa to Ceftazidime and Ciprofloxacin. It has been observed that Ceftazidime does not induce the SOS response nor mutagenesis, unlike Ciprofloxacin. We show that the three TLS polymerases are involved in the mutagenesis induced by Ciprofloxacin and hydrogen peroxide. Also, we observed that the loss of any of the polymerases significantly altered the spectrum of spontaneous mutations induced by Ciprofloxacin and that have redundant functions in this mutagenic process. Thus, we have shown that TLS polymerases are important for Ciprofloxacin-induced mutagenesis in P. aeruginosa, and may be implicated in adaptive mutagenesis and consequently bacterial resistance.

Neste trabalho, foram analisados alguns sistemas bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em diferentes tecidos de moluscos bivalves, em resposta a diferentes tipos de estresse ambiental, com o intuito de se verificar a possibilidade de utilização destes sistemas em programas de biomonitoramento do ambiente marinho, assim como verificar a influência de variações em parâmetros ambientais não relacionados à poluição sobre esses sistemas. Mexilhões Perna perna e Mytella guyanensis coletados em ambientes poluídos apresentaram níveis significativamente maiores de lesões em DNA e lipídeos que animais coletados em local limpo. Além disso, mexilhões expostos a metais apresentaram também maiores níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados indicam que as lesões analisadas nos mexilhões apresentaram uma boa resposta aos diferentes contaminantes, o que sugere sua utilização como biomarcadores da contaminação ambiental marinha. Entretanto, outros fatores tais como os ciclos de exposição ao ar, sazonalidade e variações de salinidade também ocasionaram oscilações nos níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados sugerem que deve-se ter especial atenção às condições de coleta em estudos de biomonitormanento ambiental, uma vez que variações ambientais não controladas em fatores abióticos podem influenciar nos resultados obtidos Em mexilhões expostos a diferentes metais em laboratório por diferentes períodos, foram estudadas as atividades de algumas enzimas antioxidantes tais como a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa peroxidase específica para hidroperóxidos de lipídeos (PHGPx), glutationa S-transferase (GST), níveis de glutationa reduzida (GSH) e de peroxidação lipídica. Algumas oscilações foram observadas nestes parâmetros, em relação à susceptibilidade dos tecidos à peroxidação lipídica. As maiores correlações foram observadas entre a atividade da PHGPx e os níveis de peroxidação lipídica, indicando um possível papel protetor da PHGPx contra lesões oxidativas às membranas, como também sua modulação pelos metais. Níveis de serotonina (5HT) e dopamina (DOPA) foram também avaliados em glândulas digestivas e tecido muscular de mexilhões P. perna, onde verificou-se que os metais causaram depleção dos níveis de 5HT e DOPA. No caso específico de tecidos musculares, uma diminuição dos níveis destes dois compostos poderia ser devido à contração tônica das valvas dos mexilhões em resposta a presença dos metais, uma vez que estes dois compostos estão envolvidos no relaxamento muscular dos mexilhões. Quando mexilhões foram expostos ao ar, constatamos também uma diminuição nos níveis de 5HT e DOPA no músculo, o que provavelmente estava associado à contração muscular para o fechamento das valvas, evitando assim a dessecação. Ao serem re-submersos, os níveis voltaram aos anteriores (similares aos controles), o que indicaria o relaxamento dos músculos com a conseqüente abertura das valvas. Nenhuma diferença foi observada nas glândulas digestivas. Pequenas variações foram também observadas nos níveis de 5HT e DOPA, entre mexilhões coletados em diferentes horários do dia, indicando o papel destes dois compostos no controle dos ritmos biológicos. Sendo assim, oscilações nos níveis destes dois compostos em função da exposição a metais pesados podem comprometer também os ritmos biológicos destes animais. Ainda, em estudos adicionais foi caracterizado por cromatografia líquida de alta performance acoplado à espectrometria de massas (HPLC/MS) e por ressonância magnética nuclear de próton e carbono, o produto de oxidação da melatonina pelo oxigênio singlete, o AFMK. Como parte deste estudo, comprovamos a hipótese de que a reação de nitrilas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino gera oxigênio singlete, em estudos de monitoramento das emissões de luz bi e monomoleculares do oxigênio singlete, e pela detecção do produto acetamida por HPLC/MS. Por fim, um novo método de detecção de melatonina e AFMK com alta especificidade e sensibilidade por HPLC/MS foi desenvolvido. / In this work, some biochemical systems were evaluated in different tissues of bivalve mollusks, in response to different stress, in order to verify the possibility of use of these systems as pollution bioindicators in marine environmental monitoring studies, as well as to verify the influence of environmental variations not related to pollution on these systems. Mussels Mytella guyanensis and Perna perna collected in polluted environments presented higher levels of DNA and lipid damage, compared to mussels from a reference site. Mussels exposed to different metals also presented high levels of DNA and lipid damage. These data indicates that the lesions evaluated in mussels showed good responses to the contaminants, suggesting its use as biomarkers of marine contamination. On the other hand, other environmental variations such as air exposure cyvles, seasonality and variations in salinity also caused changes in the levels of DNA and lipid damage, indicating that the collection procedure of mussels, including observations of the environment conditions, should be considered for better interpretation of the results. In mussels exposed to different metal at different time intervals, the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and glutathione S-transferase (GST), as well as the levels of reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation were evaluated. Some oscillations were observed in these parameters, related to the susceptibility of the digestive gland to lipid peroxidation. Major relationships were observed between the activity of PHGPx and the levels of lipid peroxidation, suggesting a protective role of PHGPx against lipid peroxidation and its modulation by metals. The levels of serotonin (5HT) and dopamine (DOPA) were also evaluated in digestive gland and muscle tissues of the mussels, being observed 5HT and DOPA depletion in both tissues. In muscle tissues, this would be related to the tonic catch contraction of muscle fibers in response to the metal exposure, since 5HT and DOPA are involved in this process. Experiments of exposure of mussels to air and re-submersion were also done to verify the effects on 5HT and DOPA levels. When mussels were exposed to air, decreases in 5HT and DOPA were observed, and when mussels were re-submersed, the levels back to the control values, which would also be related to the muscle contraction. No differences were observed in digestive glands. Little variations in 5HT and DOPA levels were observed between mussels collected at different times of the day, indicating a role of these compounds in the control of biological rithms. Additional studies were done, were the oxidative melatonin product by singlet molecular oxygen was characterized by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC/MS), and proton and carbon nuclear magnetic resonance. The chraracterized product was the kynurenine N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK). Along this study, the theory that the reaction of nitriles with hydrogen peroxide in alkaline solutions were confirmated through monitoring of the ligh emmited by singlet oxygen and the detection of the product formed (acetamide). Also, a new method for the simultaneous detection of melatonin and AFMK with high specificity and sensibility by HPLC/MS were developed.

Neste trabalho, foram analisados alguns sistemas bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em diferentes tecidos de moluscos bivalves, em resposta a diferentes tipos de estresse ambiental, com o intuito de se verificar a possibilidade de utilização destes sistemas em programas de biomonitoramento do ambiente marinho, assim como verificar a influência de variações em parâmetros ambientais não relacionados à poluição sobre esses sistemas. Mexilhões Perna perna e Mytella guyanensis coletados em ambientes poluídos apresentaram níveis significativamente maiores de lesões em DNA e lipídeos que animais coletados em local limpo. Além disso, mexilhões expostos a metais apresentaram também maiores níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados indicam que as lesões analisadas nos mexilhões apresentaram uma boa resposta aos diferentes contaminantes, o que sugere sua utilização como biomarcadores da contaminação ambiental marinha. Entretanto, outros fatores tais como os ciclos de exposição ao ar, sazonalidade e variações de salinidade também ocasionaram oscilações nos níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados sugerem que deve-se ter especial atenção às condições de coleta em estudos de biomonitormanento ambiental, uma vez que variações ambientais não controladas em fatores abióticos podem influenciar nos resultados obtidos Em mexilhões expostos a diferentes metais em laboratório por diferentes períodos, foram estudadas as atividades de algumas enzimas antioxidantes tais como a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa peroxidase específica para hidroperóxidos de lipídeos (PHGPx), glutationa S-transferase (GST), níveis de glutationa reduzida (GSH) e de peroxidação lipídica. Algumas oscilações foram observadas nestes parâmetros, em relação à susceptibilidade dos tecidos à peroxidação lipídica. As maiores correlações foram observadas entre a atividade da PHGPx e os níveis de peroxidação lipídica, indicando um possível papel protetor da PHGPx contra lesões oxidativas às membranas, como também sua modulação pelos metais. Níveis de serotonina (5HT) e dopamina (DOPA) foram também avaliados em glândulas digestivas e tecido muscular de mexilhões P. perna, onde verificou-se que os metais causaram depleção dos níveis de 5HT e DOPA. No caso específico de tecidos musculares, uma diminuição dos níveis destes dois compostos poderia ser devido à contração tônica das valvas dos mexilhões em resposta a presença dos metais, uma vez que estes dois compostos estão envolvidos no relaxamento muscular dos mexilhões. Quando mexilhões foram expostos ao ar, constatamos também uma diminuição nos níveis de 5HT e DOPA no músculo, o que provavelmente estava associado à contração muscular para o fechamento das valvas, evitando assim a dessecação. Ao serem re-submersos, os níveis voltaram aos anteriores (similares aos controles), o que indicaria o relaxamento dos músculos com a conseqüente abertura das valvas. Nenhuma diferença foi observada nas glândulas digestivas. Pequenas variações foram também observadas nos níveis de 5HT e DOPA, entre mexilhões coletados em diferentes horários do dia, indicando o papel destes dois compostos no controle dos ritmos biológicos. Sendo assim, oscilações nos níveis destes dois compostos em função da exposição a metais pesados podem comprometer também os ritmos biológicos destes animais. Ainda, em estudos adicionais foi caracterizado por cromatografia líquida de alta performance acoplado à espectrometria de massas (HPLC/MS) e por ressonância magnética nuclear de próton e carbono, o produto de oxidação da melatonina pelo oxigênio singlete, o AFMK. Como parte deste estudo, comprovamos a hipótese de que a reação de nitrilas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino gera oxigênio singlete, em estudos de monitoramento das emissões de luz bi e monomoleculares do oxigênio singlete, e pela detecção do produto acetamida por HPLC/MS. Por fim, um novo método de detecção de melatonina e AFMK com alta especificidade e sensibilidade por HPLC/MS foi desenvolvido. / In this work, some biochemical systems were evaluated in different tissues of bivalve mollusks, in response to different stress, in order to verify the possibility of use of these systems as pollution bioindicators in marine environmental monitoring studies, as well as to verify the influence of environmental variations not related to pollution on these systems. Mussels Mytella guyanensis and Perna perna collected in polluted environments presented higher levels of DNA and lipid damage, compared to mussels from a reference site. Mussels exposed to different metals also presented high levels of DNA and lipid damage. These data indicates that the lesions evaluated in mussels showed good responses to the contaminants, suggesting its use as biomarkers of marine contamination. On the other hand, other environmental variations such as air exposure cyvles, seasonality and variations in salinity also caused changes in the levels of DNA and lipid damage, indicating that the collection procedure of mussels, including observations of the environment conditions, should be considered for better interpretation of the results. In mussels exposed to different metal at different time intervals, the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and glutathione S-transferase (GST), as well as the levels of reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation were evaluated. Some oscillations were observed in these parameters, related to the susceptibility of the digestive gland to lipid peroxidation. Major relationships were observed between the activity of PHGPx and the levels of lipid peroxidation, suggesting a protective role of PHGPx against lipid peroxidation and its modulation by metals. The levels of serotonin (5HT) and dopamine (DOPA) were also evaluated in digestive gland and muscle tissues of the mussels, being observed 5HT and DOPA depletion in both tissues. In muscle tissues, this would be related to the tonic catch contraction of muscle fibers in response to the metal exposure, since 5HT and DOPA are involved in this process. Experiments of exposure of mussels to air and re-submersion were also done to verify the effects on 5HT and DOPA levels. When mussels were exposed to air, decreases in 5HT and DOPA were observed, and when mussels were re-submersed, the levels back to the control values, which would also be related to the muscle contraction. No differences were observed in digestive glands. Little variations in 5HT and DOPA levels were observed between mussels collected at different times of the day, indicating a role of these compounds in the control of biological rithms. Additional studies were done, were the oxidative melatonin product by singlet molecular oxygen was characterized by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC/MS), and proton and carbon nuclear magnetic resonance. The chraracterized product was the kynurenine N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK). Along this study, the theory that the reaction of nitriles with hydrogen peroxide in alkaline solutions were confirmated through monitoring of the ligh emmited by singlet oxygen and the detection of the product formed (acetamide). Also, a new method for the simultaneous detection of melatonin and AFMK with high specificity and sensibility by HPLC/MS were developed.