La découverte, la caractérisation et le dosage de biomarqueurs ont permis douvrir de
nouveaux horizons tant en thérapeutique que dans létablissement dune médecine
personnalisée. Dans un contexte danalyse en milieu complexe, lapplication de
techniques fiables, sensibles, exactes et de haute résolution est de rigueur. Dans ce but,
le couplage de la spectrométrie de masse à une technique séparative telle que la
chromatographie liquide (LC-MS) ou lélectrophorèse capillaire (CE-MS) offre des
potentialités intéressantes.
Une méthode de dosage de la cysdopa, un marqueur du mélanome, dans le
plasma par LC-MS a été mise au point. Une étape préliminaire dextraction en phase
solide sur un support hybride alliant des interactions de type hydrophobe, hydrophile et
échangeurs de cations a conduit à lobtention dexcellents taux de récupération. Les
conditions chromatographiques assurant la séparation de la cysdopa des composés
endogènes susceptibles dinterférer et les paramètres de la détection par spectrométrie
de masse en tandem ont été optimisés. La présence déventuels effets de la matrice a
été investiguée en détails. Une étude de la stabilité de la cysdopa dans les différentes
conditions opératoires a été réalisée répondant ainsi aux normes préscrites par la FDA.
Ensuite, une validation complète de la méthode en milieu plasmatique selon lapproche
faisant appel aux profils dexactitude sur une gamme de concentration allant de 1,6 à
200 ng/ml a été menée avec succès démontrant ladéquation de la méthode. Enfin, une
étude pilote ainsi quune validation en cours détude ont permis de tester cette méthode
de dosage.
La seconde technique mise en oeuvre consiste en lapplication du couplage CE-MS
à lanalyse de lhepcidine, un petit peptide régulant le métabolisme du fer. Les conditions
électrophorétiques assurant la séparation de ce peptide des constituants dun mélange
type ont été déterminées. Le traitement de la paroi interne du capillaire et laddition
dune cyclodextrine nont pas permis dans la présente application daméliorer la
sélectivité et lefficacité des pics. Lutilisation dun électrolyte de haute force ionique
associé à laddition dun modificateur organique a par contre offert les meilleures
performances. Une approche multivariée en deux temps (criblage puis modélisation) a
été appliquée pour loptimisation des paramètres CE-MS. Les effets principaux du voltage
du capillaire et de la pression du gaz nébulisant se sont révélés être significatifs tout
comme leffet quadratique de ce dernier ainsi que les interactions entre la concentration
en électrolyte et le voltage du capillaire dune part et la pression du gaz nébulisant
dautre part. Finalement, la sensibilité en terme de rapport signal/bruit a été comparée
en CE-UV et CE-MS établissant les potentialités du couplage CE-MS pour lanalyse de
peptides.
Discovery, caracterization and determination of biomarkers provide new
perspectives in therapeutics and establishment of personnal medecine. Analysis in
complex matrix requires reliable, sensitive, accurate and high resolution techniques. To
achieve this, coupling of mass spectrometry with separative techniques such as liquid
chromatography (LC-MS) or capillary electrophoresis (CE-MS) offer interesting
potentialities.
A method for the determination of cysdopa, a melanoma biomarker, in human
plasma was developed using LC-MS. Solid phase extraction in mixed mode, combining
hydrophobic, hydrophilic and cation exchange interactions led to excellent recovery. The
chromatographic conditions ensuring separation of cysdopa from potential by interfering
endogenous compounds and tandem mass spectrometry detection parameters were
optimised. The presence of matrix effect was investigated in detail. A full stability study
was then performed according to FDA requirements. Finally, a complete validation of the
method in plasma following the approach of accuracy profiles over a concentration range
from 1,6 to 200 ng/ml was successfully performed, demonstrating adequacy of the
developed method. A pilot study and an in-study validation were finally perfomed to test
this assay method.
The second implemented technique consists in the application of CE-MS coupling
to hepcidin analysis, a small peptide regulating iron metabolism. Electrophoretic
conditions ensuring separation of hepcidin from model peptides have been determined.
Resolution and/or efficiency were not improved by using coated capillaries or by adding a
cyclodextrin. A high ionic strength electrolyte associated to the addition of an organic
modifier provided the best performance. A multivariate approach (screening and
modeling) was applied to the optimisation of CE-MS parameters. The principal effet of
capillary voltage and nebulizing gas pressure were significant as well as the quadratic
effet of the last parameter and the interactions of electrolyte concentration and, for one
part, capillary voltage and, for another part, nebulizing gas pressure. Finally, sensitivity
with respect to signal/noise ratio was compared between CE-UV and CE-MS, assessing
potentialities of CE-MS for peptide analysis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:BICfB/oai:ETDULg:ULgetd-12102009-090802 |
| Date | 16 December 2009 |
| Creators | Martin, Gaëlle |
| Contributors | VAN EECKHAUT, Ann, DE GRAEVE, Jean, HUBERT, Philippe, CHIAP, Patrice, BOULANGER, Bruno, CROMMEN, Jacques, CHAPELLE, Jean-Paul, FILLET, Marianne, VEUTHEY, Jean-Luc |
| Publisher | Universite de Liege |
| Source Sets | Bibliothèque interuniversitaire de la Communauté française de Belgique |
| Detected Language | French |
| Type | text |
| Format | application/pdf |
| Source | http://bictel.ulg.ac.be/ETD-db/collection/available/ULgetd-12102009-090802/ |
| Rights | restricted, Je certifie avoir complété et signé le contrat BICTEL/e remis par le gestionnaire facultaire. |
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