Orientador : Profª. Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Coorientador : Prof. Dr. Attilio di Pietro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/10/2015 / Inclui referências: fls.138-150 / Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) possui uma alta taxa de mortalidade e apenas um quimioterápico, com eficiência limitada, está disponível para seu tratamento. Buscando potenciais drogas para o tratamento do CHC, neste estudo foram avaliados os efeitos de derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos (MI-D, MI-J, MI-F e MI-2,4diF) em células de hepatocarcinoma humano (HepG2) e em hepatócitos de rato em cultura. A viabilidade das células HepG2, avaliada pelo método do MTT, foi reduzida em ~50% pelos derivados (25 ?M para MI-J, MI-F, MI-2,4diF e 50 ?M para MI-D - 24h). Esta citotoxicidade foi confirmada pelo aumento da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) no meio extracelular, em ? 55, 24 e 16% após incubação com MI-D, MI-J e MI-F (25 ?M - 24 h), respectivamente. Nestas condições, análises por citometria de fluxo mostraram um aumento no número de células marcadas com anexina V e iodeto de propídio, de ?11, 76, 25 e 25 para MI-D, MI-J, MI-F e MI-2,4diF, respectivamente. O aumento na fragmentação do DNA também foi observado, em ?12, 9 e 8% para MI-J, MI-F e MI-2,4diF, respectivamente. Alterações morfológicas características de indução de apoptose foram observadas após incubação com todos os derivados (3h - 5 ?M). Nenhuma citotoxicidade foi observada quando células não-tumorais (hepatócitos de ratos) foram tratadas com os compostos na concentração de 25 ?M por 24 h. Neste estudo também se investigou a interação destes derivados com os principais transportadores responsáveis pela resistência aos tratamentos quimioterápicos: Pgp, ABCG2 e MRP1. MI-D, MI-4F e MI-2,4diF foram substratos de Pgp (RR= 2,4; 2,8 e 5,2), cuja atividade transportadora foi inibida por MI-J (? 13% - 30min). Todos os derivados inibiram tanto a atividade de ABCG2 (? 37, 21, 12 e 18 % para MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) quanto de MRP1 (? 8, 36, 10 e 20% para MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF -30min). Ainda neste estudo, novos inibidores de ABCG2 foram desenvolvidos através de substituições apropriadas nos anéis do núcleo indeno[1,2-b]indol. Foram obtidos potentes inibidores de ABCG2 (4c, 4h, 4i, 4j, 4k - IC50= 0,21-0,49 ?M - N5 = fenetila) ou da caseína quinase II (CK2) (4a, 4p, 4e - IC50= 0,0025-0,36 ?M N5 = isopropila) quando o núcleo cetônico indeno[1,2-b]indol foi utilizado. Os derivados 4h, 4j, 4l e 4d apresentaram baixa citotoxicidade intrínseca (IG50 28-100 ?M), o que resultou em índices terapêuticos (IT) aceitáveis para utilização em modelos in vivo (IT= 98-430), entretanto, 4h, 4j, 4k não foram seletivos em relação à atividade inibitória em MRP1 (44, 87 e 86% - 10 ?M). A utilização de um núcleo fenólico indeno[1,2-b]indol resultou em inibidores com maior potência (5c, 5f, 5h- IC50= 0,15-0,16 ?M) e seletividade em CK2, Pgp e MRP1. Baixa citotoxicidade intrínseca (5c, 5f, 5h- IG50= 42-54 ?M) e alto IT (267-360) também foram encontrados. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos e indeno[1,2-b]indóis fenólicos são candidatos promissores para futuras investigações in vivo visando o tratamento do CHC e a quimiosensibilização de tumores superexpressando ABCG2, respectivamente. Palavras-chave: Carcinoma hepatocelular. Células HepG2. Cultura primária de hepatócitos. Derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos. Derivados indeno[1,2-b]indóis. Inibidores de ABCG2. / Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) has a high mortality rate and only one chemotherapy drug is available for its treatment, which has limited efficacy. Aiming to find potential drugs for HCC treatment, in this study the effects of 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives (MI-D, MI-J, MI-F and MI-2,4diF) were evaluated on human hepatocellular carcinoma cells (HepG2) and primary rat hepatocytes. The viability of HepG2 was reduced by ~ 50% after treatment with derivatives (25 ?M for MI-J, MI-F and MI-2,4diF and 50 ?M for MI-D- 24h), as shown by MTT assay. The cytotoxicity was confirmed by the increase of lactate dehydrogenase (LDH) in cells supernatant at 55, 24 and 16% for MI-J, MI-4F and MI-2,4diF, respectively (at 25 ?M after 24 h). Under same conditions, all compounds increased the number of cell doubly-stained with annexin V and PI (76% for MI-J, 25% for MI-4F and MI-2,4diF, and 11% for MI-D), as demonstrated by flow cytometry. DNA fragmentation was also observed upon MI-J, MI-4F and MI-2,4diF treatment (by 12%, 9% and 8%, respectively). Morphological features of apoptosis induction were observed after incubation with all derivatives (3h - 5 ?M). It was not observed cytotoxicity when non-tumor hepatocytes were treated with derivatives (25 ?M - 24h). This study also investigated the interaction of these derivatives with the main transporters related to chemotherapy resistance: Pgp, ABCG2 and MRP1. MI-D, MI-4F e MI-2,4diF were Pgp substrates (RR = 2.4; 2.8 and 5.2), and MI-J inhibited the transporter activity of Pgp by 13% (30 min). All derivatives inhibited both ABCG2 (by ? 37, 21, 12 and 18 % for MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) and MRP1(? 8, 36, 10 and 20% for MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) transporter activity. New ABCG2 inhibitors were developed through substitutions in indeno[1,2-b]indoles scaffold. Potent ABCG2 (4c, 4h, 4i, 4j, 4k - IC50= 0.21-0.49 ?M - N5 = phenethyl) or casein kinase II (CK2) (4a, 4p, 4e - IC50= 0.0025-0.36 ?M N5 = isopropyl) inhibitors were obtained with a cetonic indeno[1,2-b]indoles scaffold. The derivatives 4j, 4l and 4d showed low intrinsic cytotoxicity (IG50 28-100 ?M), resulting in therapeutic ratio (TR) suitable for use on in vivo models (TR = 98-430). However, the derivatives 4h, 4j, 4k were not selective to ABCG2, also inhibiting MRP1 activity (44, 87 e 86% - 10 ?M). The derivatives of phenolic indeno[1,2-b]indoles were more potent (5c, 5f, 5h- IC50= 0.15-0.16 ?M) and selective to ABCG2 than cetonic derivatives. Low intrinsic cytotoxicity (5c, 5f, 5h- IG50= 42-54 ?M) and high TR (267-360) were also observed. These results suggest that 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives and indeno[1,2-b]indoles are promising candidates for future investigations on in vivo, targeting HCC treatment and chemosensitization of tumors overexpressing ABCG2, respectively. Keywords: Hepatocellular carcinoma. HepG2 cells. Primary rat hepatocytes. 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives. Indeno[1,2-b]indoles derivatives. ABCG2 inhibitors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/48878 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Gozzi, Gustavo Jabor |
| Contributors | Pietro, Attilio Di, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica), Cadena, Silvia Maria Suter Correia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 161 f. : il. algumas color., grafs., tabs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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