Resumo: Polissacarídeos das mais diversas fontes vêm sendo estudados quanto suas aplicações biológicas. Dentre esses polissacarídeos, destacam-se as galactomananas de fontes vegetais, que podem ser obtidas em forma pura e com um alto rendimento. Sementes de Schizolobium amazonicum, uma árvore brasileira nativa, contém galactomananas. O objetivo deste trabalho foi extrair e sulfatar quimicamente a galactomanana de S. amazonicum e avaliar as potenciais propriedades citotóxicas do polissacarídeo nativo e modificado em células do hepatocarcinoma humano (HepG2). Por extração aquosa do endosperma das sementes de S. amazonicum foi isolada uma galactomanana de relação Man:Gal 3,2:1 (SN) e massa molar 4,34 x 105 g/mol, determinada por espalhamento de luz. Análises de RMN 13C e HPSEC demonstraram que o polissacarídeo estava livre de contaminantes e apresentava a estrutura clássica de galactomananas. A fração SN foi submetida à sulfatação utilizando ácido clorossulfônico, resultando nas frações S1 e S2, as quais apresentaram grau de sulfatação (DS) de 0,4 e 0,6, respectivamente. A sulfatação foi confirmada pela presença de bandas típicas no espectro de FT-IR e as análises de HPSEC indicaram que o processo de sulfatação também promoveu degradação da galactomanana. As análises de RMN 13C indicaram que a sulfatação ocorreu preferencialmente nas hidroxilas dos carbonos 6 da galactose e manose não substituídas. No ensaio de citotoxicidade pelo método do MTT, após 72 horas de tratamento das células HepG2, a galactomanana na sua forma nativa (SN) diminuiu a viabilidade celular cerca de 30%, 35% e 50% nas concentrações de 50, 100 e 250 ?g.mL-1 respectivamente. A galactomanana sulfatada com DS 0,4 (S1) nas concentrações de 100 e 250 ?g.mL-1 promoveu um decréscimo na viabilidade dessas células em ~25% e 30%, respectivamente. No entanto, a galactomanana com D.S. de 0,6 não exerceu efeito na viabilidade celular. Pelo método do cristal violeta, nas mesmas condições de tratamento, SN, S1 e S2, não interferiram na viabilidade dessas células. Ao avaliar o mecanismo de citotoxicidade por citometria de fluxo observou-se que a galactomanana nativa na concentração de 250 ?g.mL-1 também não promoveu a parada do ciclo celular e não foi capaz de induzir a morte celular das células HepG2, em 72 horas de tratamento. Galactomananas nativa e sulfatada (S1) promoveram diminuição no consumo de oxigênio nas células HepG2 não permeabilizadas, após 72 horas de tratamento, nos quatro estados avaliados da respiração celular. No estado basal, na maior dose avaliada (250 ?g.mL-1) SN e S1 exerceram uma inibição de ~80% em relação ao controle. No estado leak, os dois polímeros (SN e S1) exerceram uma diminuição no consumo de O2 em ~50% em todas as concentrações avaliadas e no estado desacoplado da respiração a diminuição do consumo de oxigênio foi ~90% para ambas as concentrações avaliadas. Tanto a galactomanana nativa quanto a sulfatada (S1) causaram um aumento na produção de lactato de aproximadamente 15% e consequentemente uma diminuição nos níveis de piruvato. Os efeitos apresentados pela galactomanana na sua forma nativa e sulfatada sobre o metabolismo mitocondrial a produção de lactato e piruvato nas células HepG2 sugerem que esses polímeros são modificadores de resposta biológica.

Orientadora : Profª. Drª. Guilhermina Rodrigues Noleto / Coorientadora : Profª. Drª. Carmen Lúcia de Oliveira Petkowicz / Coorientadora : Profª. Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 07/07/2017 / Inclui referências: fls. 138-159 / Resumo: Nesse estudo, foi avaliada a toxicidade de preparações de galactomananas isoladas de sementes de Schizolobium amazonicum e de seus complexos com oxovanádio em células HepG2, com enfoque nos efeitos sobre o metabolismo energético. A galactomanana nativa (SAGM) foi obtida do endosperma das sementes de S. amazonicum por extração aquosa a 25 ºC. O polímero nativo foi submetido à hidrólise ácida parcial resultando na fração MSAGM. A comparação dos perfis de eluição por HPSEC/MALLS/RI das galactomananas nativa e modificada confirmou a hidrólise parcial. A massa molecular de MSAGM obtida por MALLS foi de 1,56 x 104 g/mol. A razão Man:Gal de 3,2:1, determidada por GC, não foi alterada em relação a galactomanana nativa. SAGM e MSAGM foram complexadas com oxovanádio, sendo denominadas SAGM:VO e MSAGM:VO, respectivamente. A complexação dos biopolímeros com oxovanádio (IV/V) foi caracterizada por titulação potenciométrica, FT-IR, RMN 51V e 13C. A técnica de absorção atômica foi utilizada para determinar a presença do metal nos complexos. Os valores das constantes de complexação para os equilíbrios químicos foram similares para ambas as preparações, exceto para o equilíbrio [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 que foi detectado apenas para MSAGM:VO. Para o complexo SAGM:VO o conteúdo de vanádio foi 3,8 vezes maior ao do complexo MSAGM:VO. Dentre os polímeros, SAGM e MSAGM:VO promoveram maior redução (~ 50%) na viabilidade das células HepG2 na concentração de 250 ?g/mL durante 72h de incubação. Nas mesmas condições somente MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu inibição de ~50% na proliferação destas células. Ambos os polímeros também inibiram todos os estados da respiração (basal: ~70%; desacoplado: ~80%, e leak: ~40%). Este efeito se repetiu também em células permeabilizadas, nas quais foi observada a inibição da respiração em ~50%, que se manteve após a adição de ADP, glutamato/malato e succinato, estes últimos substratos para os complexos I e II, respectivamente. A concentração de lactato das células HepG2 incubadas com SAGM (250 ?g/mL) por 72h aumentou em ~25%, porém para SAGM:VO, MSAGM e MSAGM:VO (250 ?g/mL) houve redução de ~20%. Nas mesmas condições, a presença dos biopolímeros não alterou significativamente a concentração de piruvato. Os níveis de ATP foram reduzidos em ~30% após o tratamento de 72h com 250 ?g/mL com todas as preparações. MSAGM:VO aumentou os níveis de ROS em ~149%, enquanto o potencial transmembrana mitocondrial (??m) foi reduzido em ~47%. A análise da morte celular em condição de normóxia, após 72 h, mostrou que MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu o aumento da atividade de caspases (3 e 7) envolvidas na morte celular por apoptose e, em menor intensidade, a proteína pro-apoptótica BAX. Porém, em condições de hipóxia, o biopolímero aumentou a expressão das proteínas anti-apoptóticas MCL-1 e BCL-XL. Também nesta condição (hipóxia), o tratamento com MSAGM:VO promoveu aumento das proteínas LC3-II e redução de p62, sugerindo o processo de autofagia. Os níveis de expressão de HIF-1? em condições de hipóxia foram reduzidos após o tratamento com MSAGM:VO (250 ?g/mL e 72h). Esses resultados demonstram que as preparações das galactomananas de S. amazonicum, especialmente, SAGM e MSAGM:VO, tornam as células HepG2 suscetíveis a morte e sugerem que estes polímeros tem potencial atividade antitumoral, motivando estudos futuros que viabilizem sua aplicação terapêutica. Além do estudo realizado com as galactomananas de S. amazonicum, o outro objetivo desse estudo foi avaliar o impacto do silenciamento da enzima glucose - 6 - fosfato isomerase (GPI) em células LS174T. GPI é uma enzima citosólica que realiza a interconversão de glucose - 6 - fosfato em frutose - 6 - fosfato. A interrupção genética desta enzima em células LS174T (GPIKO) foi realizada de forma a desviar o metabolismo dessas células para a via das pentoses fosfato. Após o silenciamento de GPI, em condições de normóxia, foi observado uma redução de glucose e lactato, reprogramando as células GPIKO para a fosforilação oxidativa de forma a elevar os níveis de ATP mitocondrial, mantendo assim a viabilidade. A incubação com fenformina nas células GPIKO, levaram as células a morte, indicando sensibilidade ao inibidor do complexo I da cadeia de transporte de elétrons. Em condições de hipóxia, GPIKO teve seu crescimento celular reduzido, caracterizado pela diminuição da proliferação e respiração celular. Apesar da restrição do crescimento in vitro sob hipóxia, o crescimento tumoral in vivo reduziu moderamente em comparação ao tipo selvagem, o qual não apresentava a mutação. Esses resultados indicam que a utilização exclusiva do metabolismo oxidativo tem a capacidade de fornecer precursores metabólicos para o crescimento tumoral, apontando a plasticidade do metabolismo das células tumorais apresentarem uma forte limitação para estratégias antitumorais. Palavras - chave: galactomananas; oxovanadio (IV/V); células HepG2; células LS174T; GPI; metabolismo; efeitos citotóxicos; antitumoral; hipóxia. / Abstract: The aim of this study, was evaluated the toxicity of galactomannan preparations isolated from seeds of S. amazonicum and its complexes with oxovanadium in HepG2 cells, focusing on effects of energy metabolism. Native galactomannan (SAGM) was obtained from endosperm of S. amazonicum seeds by aqueous extraction at 25 ºC. SAGM was subjected to partial acid hydrolysis resulting in the MSAGM fraction. HPSEC/MALLS/RI elution profiles of native and modified galactomannans confirmed partial hydrolysis. Molecular mass of MSAGM obtained by MALLS was 1.56 × 104 g/mol. The Man: Gal ratio of 3.2:1 determined by GC, was not modified in relation to SAGM. SAGM and its partially hydrolyzed form (MSAGM) were complexed with oxovanadium, and was called SAGM:VO and MSAGM:VO, respectively. The complexation of biopolymers with oxovanadium (IV/ V) was characterized by potentiometric titration, FT-IR, NMR 51V, 13C. Atomic absorption technique was used to determine the presence of the metal in the complexes. The values of the complexation constants for the chemical equilibria were similar for both preparations, except for the equilibrium [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 that was detected only for MSAGM:VO. For SAGM:VO complex the vanadium content was 3.8 fold greater than MSAGM:VO complex. Among the polymers, SAGM and MSAGM:VO promoted a greater reduction (~ 50%) in the viability of HepG2 cells at concentration of 250 ?g/mL during 72h of incubation. Under the same conditions only MSAGM:VO promoted ~ 50% of inhibition in the proliferation of these cells. Both polymers also inhibited all states of respiration (basal: ~ 70%, decoupled: ~ 80%, and leak: ~ 40%). This effect was also repeated in permeabilized cells, in which respiration inhibition was observed in ~ 50%, which was maintained after the addition of ADP, glutamate/malate and succinate (substrates for complexes I and II, respectively). Lactate concentration of HepG2 cells incubated with SAGM (250 ?g/mL) for 72h increased by ~ 25%, but for SAGM:VO, MSAGM and MSAGM:VO, there was a ~ 20% reduction. Under the same conditions, the presence of the biopolymers did not significantly alter the concentration of pyruvate. ATP levels were reduced by ~ 30% after treatment of 72 h at 250 ?g/ml with all preparations. MSAGM:VO increased ROS levels by ~ 149%, while mitochondrial transmembrane potential (??m) was reduced by ~ 47%. The analysis of cell death in normoxic condition, after 72h, showed that MSAGM:VO (250 ?g / mL) promoted an increase of caspase activity (3 and 7) and, to a lesser extent, protein BAX. However, under hypoxia conditions, the biopolymer increased expression of the anti-apoptotic proteins MCL- 1 and BCL-XL. Also in this condition, treatment with MSAGM:VO promoted increase of LC3-II proteins and reduction of p62, suggesting the autophagy process. Expression levels of HIF-1? under hypoxia conditions were reduced after treatment with MSAGM:VO (250 ?g/mL and 72 h). These results demonstrate that the preparations of galactomannans from S. amazonicum, especially SAGM and MSAGM:VO, render HepG2 cells susceptible to death and suggest that these polymers have a potential antitumor activity, motivating future studies that allow their therapeutic application. In addition to the study carried out with galactomannans from S. amazonicum, the other aim of this study was to evaluate the impact of disruption glucose - 6 - phosphate isomerase (GPI) on LS174T cells. GPI is a cytosolic enzyme that performs glucose - 6 - phosphate interconversion to fructose - 6 - phosphate. Genetic disruption of this enzyme in LS174T cells (GPIKO) was performed in a way to divert the metabolism of these cells to the phosphate pentose pathway. After GPI silencing under conditions of normoxia, a reduction of glucose and lactate was observed, reprogramming GPIKO cells for oxidative phosphorylation in order to raise mitochondrial ATP levels, thus maintaining viability. Incubation with phenformin in GPIKO cells led the cells to death, indicating sensitivity to the inhibitor of the complex I of the electron transport chain. Under hypoxia conditions, GPIKO had a reduced cell growth, characterized by decreased proliferation and cellular respiration. Despite in vitro growth restriction under hypoxia, tumor growth in vivo moderately reduced compared to wild type, which did not show the mutation. These results indicate that the exclusive use of oxidative metabolism has the ability to provide metabolic precursors for tumor growth, pointing out that the plasticity of tumor cell metabolism has a strong limitation for antitumor strategies. Key - words: galactomannan; Oxovanadium (IV/V); HepG2 cells; LS174T cells; metabolism; GPI; Cytotoxic effects; Antitumor; Hypoxia.

Orientador : Profª. Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Coorientador : Prof. Dr. Attilio di Pietro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/10/2015 / Inclui referências: fls.138-150 / Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) possui uma alta taxa de mortalidade e apenas um quimioterápico, com eficiência limitada, está disponível para seu tratamento. Buscando potenciais drogas para o tratamento do CHC, neste estudo foram avaliados os efeitos de derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos (MI-D, MI-J, MI-F e MI-2,4diF) em células de hepatocarcinoma humano (HepG2) e em hepatócitos de rato em cultura. A viabilidade das células HepG2, avaliada pelo método do MTT, foi reduzida em ~50% pelos derivados (25 ?M para MI-J, MI-F, MI-2,4diF e 50 ?M para MI-D - 24h). Esta citotoxicidade foi confirmada pelo aumento da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) no meio extracelular, em ? 55, 24 e 16% após incubação com MI-D, MI-J e MI-F (25 ?M - 24 h), respectivamente. Nestas condições, análises por citometria de fluxo mostraram um aumento no número de células marcadas com anexina V e iodeto de propídio, de ?11, 76, 25 e 25 para MI-D, MI-J, MI-F e MI-2,4diF, respectivamente. O aumento na fragmentação do DNA também foi observado, em ?12, 9 e 8% para MI-J, MI-F e MI-2,4diF, respectivamente. Alterações morfológicas características de indução de apoptose foram observadas após incubação com todos os derivados (3h - 5 ?M). Nenhuma citotoxicidade foi observada quando células não-tumorais (hepatócitos de ratos) foram tratadas com os compostos na concentração de 25 ?M por 24 h. Neste estudo também se investigou a interação destes derivados com os principais transportadores responsáveis pela resistência aos tratamentos quimioterápicos: Pgp, ABCG2 e MRP1. MI-D, MI-4F e MI-2,4diF foram substratos de Pgp (RR= 2,4; 2,8 e 5,2), cuja atividade transportadora foi inibida por MI-J (? 13% - 30min). Todos os derivados inibiram tanto a atividade de ABCG2 (? 37, 21, 12 e 18 % para MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) quanto de MRP1 (? 8, 36, 10 e 20% para MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF -30min). Ainda neste estudo, novos inibidores de ABCG2 foram desenvolvidos através de substituições apropriadas nos anéis do núcleo indeno[1,2-b]indol. Foram obtidos potentes inibidores de ABCG2 (4c, 4h, 4i, 4j, 4k - IC50= 0,21-0,49 ?M - N5 = fenetila) ou da caseína quinase II (CK2) (4a, 4p, 4e - IC50= 0,0025-0,36 ?M N5 = isopropila) quando o núcleo cetônico indeno[1,2-b]indol foi utilizado. Os derivados 4h, 4j, 4l e 4d apresentaram baixa citotoxicidade intrínseca (IG50 28-100 ?M), o que resultou em índices terapêuticos (IT) aceitáveis para utilização em modelos in vivo (IT= 98-430), entretanto, 4h, 4j, 4k não foram seletivos em relação à atividade inibitória em MRP1 (44, 87 e 86% - 10 ?M). A utilização de um núcleo fenólico indeno[1,2-b]indol resultou em inibidores com maior potência (5c, 5f, 5h- IC50= 0,15-0,16 ?M) e seletividade em CK2, Pgp e MRP1. Baixa citotoxicidade intrínseca (5c, 5f, 5h- IG50= 42-54 ?M) e alto IT (267-360) também foram encontrados. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos e indeno[1,2-b]indóis fenólicos são candidatos promissores para futuras investigações in vivo visando o tratamento do CHC e a quimiosensibilização de tumores superexpressando ABCG2, respectivamente. Palavras-chave: Carcinoma hepatocelular. Células HepG2. Cultura primária de hepatócitos. Derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos. Derivados indeno[1,2-b]indóis. Inibidores de ABCG2. / Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) has a high mortality rate and only one chemotherapy drug is available for its treatment, which has limited efficacy. Aiming to find potential drugs for HCC treatment, in this study the effects of 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives (MI-D, MI-J, MI-F and MI-2,4diF) were evaluated on human hepatocellular carcinoma cells (HepG2) and primary rat hepatocytes. The viability of HepG2 was reduced by ~ 50% after treatment with derivatives (25 ?M for MI-J, MI-F and MI-2,4diF and 50 ?M for MI-D- 24h), as shown by MTT assay. The cytotoxicity was confirmed by the increase of lactate dehydrogenase (LDH) in cells supernatant at 55, 24 and 16% for MI-J, MI-4F and MI-2,4diF, respectively (at 25 ?M after 24 h). Under same conditions, all compounds increased the number of cell doubly-stained with annexin V and PI (76% for MI-J, 25% for MI-4F and MI-2,4diF, and 11% for MI-D), as demonstrated by flow cytometry. DNA fragmentation was also observed upon MI-J, MI-4F and MI-2,4diF treatment (by 12%, 9% and 8%, respectively). Morphological features of apoptosis induction were observed after incubation with all derivatives (3h - 5 ?M). It was not observed cytotoxicity when non-tumor hepatocytes were treated with derivatives (25 ?M - 24h). This study also investigated the interaction of these derivatives with the main transporters related to chemotherapy resistance: Pgp, ABCG2 and MRP1. MI-D, MI-4F e MI-2,4diF were Pgp substrates (RR = 2.4; 2.8 and 5.2), and MI-J inhibited the transporter activity of Pgp by 13% (30 min). All derivatives inhibited both ABCG2 (by ? 37, 21, 12 and 18 % for MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) and MRP1(? 8, 36, 10 and 20% for MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) transporter activity. New ABCG2 inhibitors were developed through substitutions in indeno[1,2-b]indoles scaffold. Potent ABCG2 (4c, 4h, 4i, 4j, 4k - IC50= 0.21-0.49 ?M - N5 = phenethyl) or casein kinase II (CK2) (4a, 4p, 4e - IC50= 0.0025-0.36 ?M N5 = isopropyl) inhibitors were obtained with a cetonic indeno[1,2-b]indoles scaffold. The derivatives 4j, 4l and 4d showed low intrinsic cytotoxicity (IG50 28-100 ?M), resulting in therapeutic ratio (TR) suitable for use on in vivo models (TR = 98-430). However, the derivatives 4h, 4j, 4k were not selective to ABCG2, also inhibiting MRP1 activity (44, 87 e 86% - 10 ?M). The derivatives of phenolic indeno[1,2-b]indoles were more potent (5c, 5f, 5h- IC50= 0.15-0.16 ?M) and selective to ABCG2 than cetonic derivatives. Low intrinsic cytotoxicity (5c, 5f, 5h- IG50= 42-54 ?M) and high TR (267-360) were also observed. These results suggest that 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives and indeno[1,2-b]indoles are promising candidates for future investigations on in vivo, targeting HCC treatment and chemosensitization of tumors overexpressing ABCG2, respectively. Keywords: Hepatocellular carcinoma. HepG2 cells. Primary rat hepatocytes. 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives. Indeno[1,2-b]indoles derivatives. ABCG2 inhibitors.

Orientador : Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Coorientadoras : Drª. Amanda do Rocio Andrade Pires ; Drª. Julie St-Pierre / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 26/10/2016 / Inclui referências: f. 78-97 / Resumo: Diferentes atividades biológicas têm sido atribuídas aos compostos mesoiônicos. Para a sidnona SYD-1 (3-[4-cloro-3-nitrofenil]-1,2,3-oxadiazolio-5-olato) foi descrita significativa atividade antitumoral contra Sarcoma 180, carcinoma de Erlich e Walker-256. Neste estudo foram avaliados os efeitos do SYD-1 em células de hepatocarcinoma humano (HepG2), considerando sua elevada taxa de mortalidade e a existência de apenas um quimioterápico para o seu tratamento. Os efeitos do mesoiônico foram avaliados em células cultivadas em meio DMEM alta glucose (AG) e DMEM sem glucose e com galactose/glutamina (GAL) para direcionar o metabolismo destas células para a via glicolítica e fosforilação oxidativa, respectivamente. Ainda, com o fim de estabelecer uma possível seletividade, alguns ensaios também foram realizados em hepatócitos de rato em cultura mantidos em meio DMEM AG. SYD-1 reduziu de forma concentração dependente a viabilidade das células HepG2, avaliada por quatro metodologias diferentes. Pelo método do MTT, as reduções foram de ~22% e ~49% para 50 ?M de SYD-1, para células cultivadas em meio AG e GAL, respectivamente. Resultado similar foi obtido com a coloração com cristal violeta e atividade da enzima LDH no meio extracelular. No entanto, nenhum efeito foi observado utilizando a metodologia de exclusão do azul de tripan. Todos os estados da respiração (basal, leak e desacoplado), em células cultivadas, foram inibidos após o tratamento das células HepG2 com SYD-1 (25 e 50 ?M), sendo mais acentuado o efeito nas culturas mantidas em meio GAL. Nas mesmas condições, foi observada a diminuição nos níveis celulares de ATP (~29%). Os níveis de piruvato, por sua vez, diminuíram nas células tratadas com 50 ?M do SYD-1, com consequente aumento dos níveis de lactato. Em células cultivadas em meio AG, SYD-1 (50 ?M), após 24h de tratamento, também foi capaz de aumentar a expressão de PGC1? e reduzir a expressão de PGC1?. Após 72h de tratamento, com a mesma concentração de SYD-1, houve um aumento na expressão de PGC1?, bem como seus alvos downstream NFR1, NFR2 e Ndufb5 e, também da expressão de genes relacionados com a atividade antioxidante celular: CAT, PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3). SYD-1 (50 ?M) aumentou a expressão de caspase 3 em células HepG2 mantidas em meio AG, mas houve uma diminuição quando as células foram mantidas em meio GAL. Os níveis dos metabólitos piruvato, citrato ?-cetoglutarato e succinato também se apresentaram aumentados após tratamento com o composto (50 ?M meio AG). SYD-1 (25 ?M) inibiu ABCG2 e não foi substrato para transportadores relacionados à resistência aos tratamentos quimioterápicos (Pgp, ABCG2 e MRP1). SYD-1 diminuiu a viabilidade dos hepatócitos não tumorais somente na maior concentração (50 ?M) após 18h de tratamento. Ensaios com anexina V e iodeto de propídio sugeriram que esta redução deve-se à indução de apoptose nestas células. Considerados em conjunto, os resultados sugerem que o comprometimento de funções mitocondriais pelo SYD-1 está relacionado com sua toxicidade em células HepG2 e que o mesoiônico é um candidato promissor para futuras investigações in vivo, visando sua aplicação para o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC). Palavras-chave: Células HepG2; hepatócitos; SYD-1; bioenergética mitocondrial; família de coativadores PGC1; transportadores ABC. / Absract: Several biological activities have been described for mesoionic compounds. The sydnone SYD-1 (3-[4-chloro-3-nitrophenyl]-1,2,3-oxadiazolium-5-olate) has shown a significant antitumour activity against Ehrlich carcinoma, Sarcoma 180 and Walker-256. In this study the effects of the mesoionic compound SYD-1 were evaluated in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2), considering its high mortality rate and that only one drug is available for its treatment. The effects of SYD-1 were evaluated on cells grown in high glucose DMEM (AG) or DMEM without glucose and with galactose/glutamine (GAL), with the aim to force the metabolism to glycolytic or oxidative phosphorylation, respectively. Further, in order to establish its selectivity, some assays were also performed in rat hepatocytes grown in AG DMEM. SYD-1 reduced the viability of HepG2 cells in a dose-dependent manner, assessed from four different methods. MTT method showed reductions of ~22% and ~49% in viability after treatment with SYD-1 (50?M) for cells grown in AG and GAL, respectively. Similar results were obtained from staining with crystal violet and release of LDH in the culture medium. However, no effect was observed when the methodology was the exclusion of trypan blue. The respiration states (basal, leak and uncoupled) were inhibited after treatment with SYD-1 (25 and 50 ?M), being the effects more pronounced in cells grown in GAL medium in comparison to AG medium. At the same conditions, it was observed the decrease of ATP levels (~29%). In turn, the levels of pyruvate decreased by the treatment with 50 ?M of SYD-1 while lactate levels increased. In cells grown in AG, SYD-1 (50 ?M) was also able to increase the expression of PGC1? and reduce the expression of PGC1?, after 24h of treatment. After 72h of treatment, SYD-1 (50 ?M) increased the expression of PGC1? as well as its downstream targets NFR1, NFR2 and Ndufb5. The expression of genes related to the antioxidant activity (CAT PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3) were also increased by SYD-1 (50 ?M). The expression of caspase 3 increased in HepG2 cells maintained in AG medium and decreased in cells at GAL medium. The levels of the metabolites pyruvate, citrate, ?-ketoglutarate and succinate were also increased after treatment with the compound (50 ?M - AG medium). SYD-1 (25 ?M) inhibited ABCG2 and was not a substrate of transporters associated to chemotherapy resistance (Pgp, MRP1 and ABCG2). SYD-1 decreased the viability of non-tumour hepatocytes only at the highest concentration (50 ?M) after 18h of treatment. Results of assays with anexin-V and PI suggested that the mesoionic was able to induce apoptosis in these cells. Taken together, these results show that the effects of SYD-1 on mitochondrial functions are related to its cytotoxicity on HepG2 cells and suggest that the mesoionic is a promising candidate for future in-vivo investigations aiming to its use for the treatment of hepatocellular carcinoma. Keywords: HepG2 cells; hepatocytes; SYD-1; mitochondrial bioenergetics, PGC1 family coactivators, ABC transportes.

Orientador :Prof. Dr. Francisco Filipak Neto / Coorientador : Prof. Dr. Frank Kjeldsen / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/03/2017 / Inclui referências / Resumo: Devido a intensa produção e incorporação de AgNP em produtos para consumo, espera-se que estas sejam, direta ou indiretamente, liberadas em ambiente naturais, o que representa uma via de exposição em potencial não apenas para a biota, mas também para humanos. Apesar de muitos estudos terem demonstrado o potencial tóxico de AgNP em células e organismos, a co-exposição com contaminantes onipresentes na natureza, como metais, pode induzir efeitos que não podem ser previstos a partir daqueles gerados por exposições isoladas. Nesta tese, as interações toxicológicas entre AgNP e Cd/Hg foram investigadas em células HepG2. No primeiro capítulo, ensaios bioquímicos, microscopia confocal e quantificação intracelular de metais indicaram que as co-exposições resultam em interações toxicológicas, sendo a associação de AgNP+Cd mais tóxica do que AgNP+Hg. Aumentos nos níveis de EROs citosólicas e mitocondrial foram observados após 2-4 h de exposição a AgNP+ Cd/Hg, porém esse efeito foi parcialmente revertido após 24 h de exposição a AgNP+Hg. Ainda, decréscimos da viabilidade celular, metabolismo, proliferação e atividade dos transportadores MDR foram mais pronunciados em células co-expostas aos contaminantes do que aos contaminantes individuais. As co-exposições levaram ao aumento da morte celular, principalmente por necrose, e aumento na concentração intracelular de Hg. Desta forma, interações toxicológicas resultam na potencialização da toxicidade de AgNP, Cd e Hg. Enquanto o aumento intracelular de Hg pode estar relacionado com a maior toxicidade de AgNP+Hg, essa lógica não é válida para os efeitos deletérios observados após a co-exposição a AgNP+Cd. Desta forma, o segundo capítulo foi conduzido de modo a explorar mais aprofundadamente os efeitos celulares e moleculares induzidos pela associação entre as AgNP e Cd. A viabilidade celular e relação ADP/ATP foram pouco alteradas após 4 h de exposição; no entanto, esses parâmetros foram substancialmente alterados após 24 h. Os resultados da análise proteômica seguiram o mesmo padrão: enquanto após 4 h as exposições aos contaminantes o proteoma total das células foi pouco alterado, após 24 h de exposição às AgNP e Cd, cerca de 7% e 2% do proteoma total foi desregulado, respectivamente, enquanto 43% deste foi alterado após co-exposição a AgNP+Cd. Resumidamente, a toxicidade desta associação parece estar envolvida com a inativação de Nrf-2, o que pode resultar na redução dos níveis da defesa antioxidante, e proteínas relacionadas aos proteossomos; redução dos níveis de proteínas envolvidas na via glicolítica e aumento nos níveis de proteínas envolvidas com a fosforilação oxidativa e metabolismo de lipídios, o que pode indicar uma tentativa de retorno às condições de homeostase energética. No entanto, essa estratégia de adaptação celular não foi suficiente para reestabelecer a homeostase de ADP/ATP e impedir a morte celular. De maneira geral, este estudo fornece as primeiras informações a respeito da interação toxicológica entre AgNP e metais não essenciais em modelo in vitro. Palavras-chave: AgNP, cádmio, mercúrio, co-exposição, interação, ensaios bioquímicos, proteômica. / Abstract: Due to the increasing production and applications of AgNP in consumer products, AgNP are expected to be, directly or indirectly, released into natural environments, representing a potential threat to the biota and humans. An increasing number of studies have described the toxic potential of AgNP in cells and organisms. However, co-exposure of AgNP with ubiquitous contaminants, such as metals, may result in non-predictable outcomes. In this thesis, toxicological interactions of AgNP, Cd and Hg were investigated in HepG2 cells. In the first chapter, biochemical endpoints, confocal microscopy and intracellular metal concentration indicated that the co-exposures led to toxicological interactions, with AgNP + Cd being more toxic to HepG2 cells than AgNP + Hg. Early (2-4 h) increases of cytosolic and mitochondrial ROS were observed in the cells co-exposed to AgNP + Cd/Hg, in comparison to the control and individual contaminants, but the effect was partially reverted in AgNP + Hg at the end of 24 h-exposure. In addition, decreases of mitochondrial metabolism, cell viability, cell proliferation and ABC-transporters activity were also more pronounced in the co-exposure groups. Foremost, co-exposure to AgNP and metals potentiated cell death (mainly by necrosis) and Hg (but not Cd) intracellular levels. Therefore, toxicological interactions seem to increase the toxicity of AgNP, Cd and Hg. While an increase of Hg uptake might be related to the increase of toxicity after exposure to AgNP+Hg, this logic is not valid for the high toxicity observed after co-exposure to AgNP+Cd. Therefore, the second chapter was conducted to further explore cellular and molecular effects induced by this co-exposure. Cell viability and ADP/ATP ratio were slightly affected after the 4 h exposure to individual and combined exposures. However, these endpoints were strongly altered after 24 h co-exposure to AgNP+Cd compared to the control and individual exposures. The proteomics data followed the same trend: minor deregulation at 4 h-exposure in all groups and 7% (AgNP), 2% (Cd) and 43% (AgNP+Cd) at 24 h-exposure. Briefly, the toxicity induced by AgNP+Cd seems to be involved the inactivation of Nrf-2, which can result in down-regulation of antioxidant defense and proteasome related proteins, down-regulation of glycolysis related proteins and upregulation of oxidative phosphorylation and lipid metabolism proteins. This may indicate an attempt to reestablish homeostasis. Thus, the adaptation strategy was not able to restore ADP/ATP homeostasis and avoid cell death. Overall, this study provides the first insights into cellular outcomes after the co-exposure to AgNP and non-essential metals. Key words: AgNP, cadmium, mercury, co-exposure, interaction, biochemical endpoints, proteomics.