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Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O receptor LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase), designado NIK1 (NSP-interacting kinases), está envolvido na resposta imunológica em plantas contra Germinivirus. NIK1 foi inicialmente descrito por interagir com a proteína viral NSP (nuclear shuttle protein), proteína que participa do transporte de DNA viral do núcleo para o citoplasma de células infectadas. Com alta similaridade estrutural a NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive Associated Kinase1), também conhecida como SERK3 (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase3), é um receptor LRR-RLK de membrana que desempenha um duplo papel em vias de sinalização, podendo atuar como um coreceptor de BRI1 na presença de BR ou mediar respostas de defesa contra patógenos. Na via de crescimento desencadeada por brassinosteróides (BRs), BAK1 interage com BRI1 (Brassinosteroid-insensitive1) na membrana plasmática e ativa a função de cinase desta proteína. Recentemente, através de dados de RNA-seq, foi demonstrado que inativação da função de NIK1 no nocaute nik1 (Salk_060808) induz a expressão de genes envolvidos na resposta a BRs e desenvolvimento, indicando uma possível comunicação cruzada entre a via de sinalização antiviral mediada por NIK1 e vias de sinalização de desenvolvimento. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o papel de NIK1 na via de resposta a BRs. Arabidopissis thaliana, linhagem nik1 nocaute, foi transformada com as construções de DNA 35S:BAK-NIK1_GFP e 35S:NIK1-BAK1_GFP, sendo que a expressão dos transgenes e localização subcelular na membrana das proteínas quiméricas foram confirmadas por RT-PCR e microscopia confocal, respectivamente. Análises fenotípicas de plantas expressando as construções quiméricas BAK1-NIK1 e NIK1-BAK1 indicaram deficiência na via de desenvolvimento induzido por BR, uma vez que o fenótipo destas plantas transgênicas se assemelharam muito ao mutante bak1-4, deficiente na sinalização por BR. Além disso, a ativação da via de sinalização por BRs foi avaliada por meio de crescimento de hipocótilo e de análise da expressão de genes marcadores induzidos por brassinolídeo (BL). Em nik1, o tratamento com BL estimulou o crescimento do hipocótilo e induziu genes marcadores associados à sinalização por BR, embora em menor intensidade do que em Col-0, indicando funcionamento da via de desenvolvimento induzida por BR nesta linhagem nocaute. Expressão de ambas as proteínas quiméricas em nik1 mutante, que expressa os genes BAK1 e BRI1 normalmente, restaurou o fenótipo insensível a BL, típico do nocaute bak1-4. Claramente, a expressão dos genes quiméricos interferiu negativamente com a via de sinalização de BR, uma vez que nas linhagens transgênicas, BL não estimulou o alongamento do hipocótilo e tampouco a indução da expressão de genes marcadores associados à via de sinalização de BR. Estes resultados indicam que as proteínas quiméricas atuam como alelos mutantes transdominantes negativos na sinalização por BR. Esta hipótese foi fundamentada pela capacidade de NIK1 de interagir com BAK1, conforme previamente demonstrado, e com o domínio cinase de BRI1, demonstrado nesta investigação por meio de duplo híbrido em leveduras. Embora não se tenha observado uma ativação aumentada da resposta a BR no nocaute nik1, provavelmente devido a redundância funcional da subfamília NIK, os fenótipos resultantes da expressão das proteínas quiméricas, contendo ou o domínio LRR ou o domínio de cinase de NIK1, sugerem que NIK1 atue como um regulador negativo da sinalização por BR. / The LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase) NIK1 (NSP-interacting kinase), is known to mediate immune response in plants against Germinivirus. NIK1 was initially described by interacting with the viral protein NSP (Nuclear shuttle protein), a protein that participates in viral DNA transport from the nucleus to the cytoplasm of infected cells. With high structural similarity with NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive-Associated Kinase1), also known as SERK3 (Somatic embryogenesis receptor Kinase3), is a membrane LRR-RLK, which plays a dual role in signaling pathways and may act as a co-receptor of BRI1 in the presence of brassinosteroide (BR) or mediate defense responses against pathogens. In the BR- triggered growth pathway, BAK1 interacts with BRI1 (Brassinosteroid-Insensitive1) in the plasma membrane and activates the kinase function of this protein. Recently, RNA- seq data revealed that inactivation of NIK1 function in the nik1 mutant (Salk_060808), caused an up-regulation of genes involved in response to BRs and development, indicating a possible cross-talk between the NIK1-mediated antiviral signaling pathway and development signaling pathways. The goal of this investigation was to evaluate the role of NIK1 in the BR response pathway. Arabidopissis thaliana, nik1 line, was transformed with the DNA constructs 35S:BAK-NIK1_GFP and 35sNIK1-BAK1_GFP, and the expression of the transgenes and subcellular localization of the chimeric proteins were confirmed by RT-PCR and confocal microscopy, respectively. BAK1- NIK1- and NIK1-BAK1-expressing plants displayed a deficiency in the BR-induced growth pathway, as the phenotypes of these transgenic lines resemble the ones of the BR signaling deficient bak1-4 mutant. Furthermore, the activation of BR signaling was evaluated through brassinolide (BL)-induced hypocotyl growth and gene expression of BR signaling-associated marker genes. BL-induced stimulation of hypocotyl elongation and induction of marker genes were observed in nik1, although to a lesser extent than in Col-0, indicating a functional BR singling in this knockout line. Expression of both chimeric proteins in the nik1 mutant, which harbors BAK1 and BRI1 normal genes, mimicked the BL insensitive phenotype, typical of the bak1-4 knockout. Clearly, the expression of the chimeric genes impacted negatively the BR signaling, as in the transgenic lines, the BL treatment did not stimulated hypocotyl growth or the induction of BR signaling marker genes. These results indicate that the chimeric proteins function as transdominant negative mutant alleles in BR signaling. This hypothesis was substantiated by the capacity of NIK1 to interact with BAK1, as previously demonstrated, and with the BRI1 kinase domain, as demonstrated in the present investigation through a two-hybrid assay in yeast. Although nik1 did not display an enhancement of the BR-induced responses, most likely due to the functional redundancy of the NIK subfamily, the resulting phenotypes of the chimeric genes expression, harboring either the NIK1 LRR or kinase domain, implicate NIK1 as a negative regulator of BR signaling.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/10301 |
| Date | 27 July 2016 |
| Creators | Ferreira, Marco Aurélio |
| Contributors | Santos, Anésia Aparecida dos, Fontes, Elizabeth Pacheco Batista |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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