Halle, Universiẗat, Diss., 1999.

Univ., Diss.--Halle, 1995.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-11T13:12:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1023168 bytes, checksum: 7610c4ff8f179f603533241473b5650d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-11T13:12:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1023168 bytes, checksum: 7610c4ff8f179f603533241473b5650d (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O receptor LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase), designado NIK1 (NSP-interacting kinases), está envolvido na resposta imunológica em plantas contra Germinivirus. NIK1 foi inicialmente descrito por interagir com a proteína viral NSP (nuclear shuttle protein), proteína que participa do transporte de DNA viral do núcleo para o citoplasma de células infectadas. Com alta similaridade estrutural a NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive Associated Kinase1), também conhecida como SERK3 (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase3), é um receptor LRR-RLK de membrana que desempenha um duplo papel em vias de sinalização, podendo atuar como um coreceptor de BRI1 na presença de BR ou mediar respostas de defesa contra patógenos. Na via de crescimento desencadeada por brassinosteróides (BRs), BAK1 interage com BRI1 (Brassinosteroid-insensitive1) na membrana plasmática e ativa a função de cinase desta proteína. Recentemente, através de dados de RNA-seq, foi demonstrado que inativação da função de NIK1 no nocaute nik1 (Salk_060808) induz a expressão de genes envolvidos na resposta a BRs e desenvolvimento, indicando uma possível comunicação cruzada entre a via de sinalização antiviral mediada por NIK1 e vias de sinalização de desenvolvimento. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o papel de NIK1 na via de resposta a BRs. Arabidopissis thaliana, linhagem nik1 nocaute, foi transformada com as construções de DNA 35S:BAK-NIK1_GFP e 35S:NIK1-BAK1_GFP, sendo que a expressão dos transgenes e localização subcelular na membrana das proteínas quiméricas foram confirmadas por RT-PCR e microscopia confocal, respectivamente. Análises fenotípicas de plantas expressando as construções quiméricas BAK1-NIK1 e NIK1-BAK1 indicaram deficiência na via de desenvolvimento induzido por BR, uma vez que o fenótipo destas plantas transgênicas se assemelharam muito ao mutante bak1-4, deficiente na sinalização por BR. Além disso, a ativação da via de sinalização por BRs foi avaliada por meio de crescimento de hipocótilo e de análise da expressão de genes marcadores induzidos por brassinolídeo (BL). Em nik1, o tratamento com BL estimulou o crescimento do hipocótilo e induziu genes marcadores associados à sinalização por BR, embora em menor intensidade do que em Col-0, indicando funcionamento da via de desenvolvimento induzida por BR nesta linhagem nocaute. Expressão de ambas as proteínas quiméricas em nik1 mutante, que expressa os genes BAK1 e BRI1 normalmente, restaurou o fenótipo insensível a BL, típico do nocaute bak1-4. Claramente, a expressão dos genes quiméricos interferiu negativamente com a via de sinalização de BR, uma vez que nas linhagens transgênicas, BL não estimulou o alongamento do hipocótilo e tampouco a indução da expressão de genes marcadores associados à via de sinalização de BR. Estes resultados indicam que as proteínas quiméricas atuam como alelos mutantes transdominantes negativos na sinalização por BR. Esta hipótese foi fundamentada pela capacidade de NIK1 de interagir com BAK1, conforme previamente demonstrado, e com o domínio cinase de BRI1, demonstrado nesta investigação por meio de duplo híbrido em leveduras. Embora não se tenha observado uma ativação aumentada da resposta a BR no nocaute nik1, provavelmente devido a redundância funcional da subfamília NIK, os fenótipos resultantes da expressão das proteínas quiméricas, contendo ou o domínio LRR ou o domínio de cinase de NIK1, sugerem que NIK1 atue como um regulador negativo da sinalização por BR. / The LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase) NIK1 (NSP-interacting kinase), is known to mediate immune response in plants against Germinivirus. NIK1 was initially described by interacting with the viral protein NSP (Nuclear shuttle protein), a protein that participates in viral DNA transport from the nucleus to the cytoplasm of infected cells. With high structural similarity with NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive-Associated Kinase1), also known as SERK3 (Somatic embryogenesis receptor Kinase3), is a membrane LRR-RLK, which plays a dual role in signaling pathways and may act as a co-receptor of BRI1 in the presence of brassinosteroide (BR) or mediate defense responses against pathogens. In the BR- triggered growth pathway, BAK1 interacts with BRI1 (Brassinosteroid-Insensitive1) in the plasma membrane and activates the kinase function of this protein. Recently, RNA- seq data revealed that inactivation of NIK1 function in the nik1 mutant (Salk_060808), caused an up-regulation of genes involved in response to BRs and development, indicating a possible cross-talk between the NIK1-mediated antiviral signaling pathway and development signaling pathways. The goal of this investigation was to evaluate the role of NIK1 in the BR response pathway. Arabidopissis thaliana, nik1 line, was transformed with the DNA constructs 35S:BAK-NIK1_GFP and 35sNIK1-BAK1_GFP, and the expression of the transgenes and subcellular localization of the chimeric proteins were confirmed by RT-PCR and confocal microscopy, respectively. BAK1- NIK1- and NIK1-BAK1-expressing plants displayed a deficiency in the BR-induced growth pathway, as the phenotypes of these transgenic lines resemble the ones of the BR signaling deficient bak1-4 mutant. Furthermore, the activation of BR signaling was evaluated through brassinolide (BL)-induced hypocotyl growth and gene expression of BR signaling-associated marker genes. BL-induced stimulation of hypocotyl elongation and induction of marker genes were observed in nik1, although to a lesser extent than in Col-0, indicating a functional BR singling in this knockout line. Expression of both chimeric proteins in the nik1 mutant, which harbors BAK1 and BRI1 normal genes, mimicked the BL insensitive phenotype, typical of the bak1-4 knockout. Clearly, the expression of the chimeric genes impacted negatively the BR signaling, as in the transgenic lines, the BL treatment did not stimulated hypocotyl growth or the induction of BR signaling marker genes. These results indicate that the chimeric proteins function as transdominant negative mutant alleles in BR signaling. This hypothesis was substantiated by the capacity of NIK1 to interact with BAK1, as previously demonstrated, and with the BRI1 kinase domain, as demonstrated in the present investigation through a two-hybrid assay in yeast. Although nik1 did not display an enhancement of the BR-induced responses, most likely due to the functional redundancy of the NIK subfamily, the resulting phenotypes of the chimeric genes expression, harboring either the NIK1 LRR or kinase domain, implicate NIK1 as a negative regulator of BR signaling.

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marina Oliveira.pdf: 1283767 bytes, checksum: 902cc2416d1d157460b534a7f6b62ed8 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The expansion of cultivated blueberry fields in Brazil is directly linked to the provision of quality seedlings to the market, which may result in the increase of production. The plant micropropagation technique enables the production and provides high quality plants, physiologically viable and healthy and free from viruses in a short space of time. Woody plants presente difficulty in the in vitro rooting, in this context the development of a more efficient system of rooting results in plants with higher physiological quality and reduction of losses during the acclimatization phase. In the first experimente the treatments consisted in 8 doses of BIOBRAS 16 (0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 mg L-1) added to the culture medium at the time of preparation. The following characteristics were evaluated: number of corns, callus diameter, number of roots, the total root length, total length, number of shoots, length of shoots, number of leaves and fresh mass. The lowest concentration of BIOBRAS 16 used (0,1 mg L-1) presented a higher percentage of rooting, root length and number of leaves, but also stimulated the development of calluses. The dose of 0,4 mg L-1 stimulated the formation of shoots and length thereof. There was no significant difference for other parameters evaluated. In the second experiment the treatments consisted in diferent doses of BIOBRAS 16 (0,1; 0,3; 0,5 mg L-1) associated to different doses of indole acetic acid (1; 3; 5 L-1 μM) added to the culture medium during preparation. The parameters evaluated were the same as the experiment 1. The use of BIOBRAS 16 associated with indolacetic acid showed a positive effect for the development of in vitro characteristics of blueberry. For rooting, the concentration of 0,3 mg L-1 BIOBRAS 16 + 5 μM AIA showed a higher percentage. Concentrations of 0,5 mg L-1 BIOBRAS 16 + 5 μM of AIA induced the formation and callus diameter, undesirable feature when the goal is rooting. For the parameters number of shoots and number of leaves, the best result was the concentration of 0,1 mg L-1 BIOBRAS 16 + 5 μM of AIA. / A expansão da área cultivada de mirtileiro no Brasil está diretamente vinculada a oferta de mudas de qualidade ao mercado, que poderá resultar em aumento da produção. A técnica da micropropagação de plantas viabiliza a produção e fornece plantas de elevada qualidade, fisiologicamente viáveis, sadias e isentas de vírus emcurto espaço de tempo. Plantas lenhosas apresentam dificuldade de enraizamento in vitro, nesse contexto o desenvolvimento de um sistema de enraizamento mais eficiente resulta em mudas com maior qualidade fisiológica e diminuição de perdas durante a fase de aclimatização. No primeiro experimento os tratamentos consistiram em 8 doses de BIOBRAS 16 (0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 mg L-1) adicionados no meio de cultura no momento do preparo. As seguintes características foram avaliadas: número de calos, diâmetro do calo, número de raízes, comprimento total de raízes, comprimento total, número de brotações, comprimento de brotações, número de folhas e massa fresca. A menor concentração de BIOBRAS 16 utilizada (0,1 mg L-1) apresentou maior percentual de enraizamento (%), comprimento de raízes (cm) e número de folhas, porém também estimulou o desenvolvimento de calos. A dose de 0,4 mg L-1 estimulou a formação de brotações e o comprimento das mesmas. Não houve diferença significativa para os demais parâmetros avaliados. No segundo experimento os tratamentos consistiram em diferentes doses de BIOBRAS 16® (0,1; 0,3; 0,5 mg L-1) associadas a diferentes doses de ácido incolacético (1; 3; 5 μM L-1) adicionados ao meio de cultura no momento do preparo. As características avaliadas foram número de calos,diâmetro do calo, número de raízes, comprimento total de raízes, comprimento total, número de brotações, comprimento de brotações, número de folhas e massa fresca. A utilização de BIOBRAS 16 associado a ácido indolacético mostrou efeito positivo para características de desenvolvimento in vitro de mirtileiro. Para enraizamento, as concentrações de 0,3 mg L-1 de BIOBRAS 16 + 5 μM de AIA apresentaram maior percentual. As concentrações de 0,5 mg L-1 de BIOBRAS 16® + 5 μM de AIA induziram a formação e diâmetro de calos, característica indesejável quando o objetivo é o enraizamento. Para as características número de brotações e número de folhas, o melhor resultado foi da concentração de 0,1 mg L-1 de BIOBRAS 16 + 5 μM de AIA.

The past decades are characterized by various efforts to provide complete sequence information of genomes regarding various organisms. The availability of full genome data triggered the development of multiplex high-throughput assays allowing simultaneous measurement of transcripts, proteins and metabolites. With genome information and profiling technologies now in hand a highly parallel experimental biology is offering opportunities to explore and discover novel principles governing biological systems. Understanding biological complexity through modelling cellular systems represents the driving force which today allows shifting from a component-centric focus to integrative and systems level investigations. The emerging field of systems biology integrates discovery and hypothesis-driven science to provide comprehensive knowledge via computational models of biological systems.<br><br> Within the context of evolving systems biology, investigations were made in large-scale computational analyses on transcript co-response data through selected prokaryotic and plant model organisms. CSB.DB - a comprehensive systems-biology database - (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/) was initiated to provide public and open access to the results of biostatistical analyses in conjunction with additional biological knowledge. The database tool CSB.DB enables potential users to infer hypothesis about functional interrelation of genes of interest and may serve as future basis for more sophisticated means of elucidating gene function. The co-response concept and the CSB.DB database tool were successfully applied to predict operons in Escherichia coli by using the chromosomal distance and transcriptional co-responses. Moreover, examples were shown which indicate that transcriptional co-response analysis allows identification of differential promoter activities under different experimental conditions. The co-response concept was successfully transferred to complex organisms with the focus on the eukaryotic plant model organism Arabidopsis thaliana. The investigations made enabled the discovery of novel genes regarding particular physiological processes and beyond, allowed annotation of gene functions which cannot be accessed by sequence homology. GMD - the Golm Metabolome Database - was initiated and implemented in CSB.DB to integrated metabolite information and metabolite profiles. This novel module will allow addressing complex biological questions towards transcriptional interrelation and extent the recent systems level quest towards phenotyping. / Die vergangenen Jahrzehnte waren gekennzeichnet durch umfangreiche Bemühungen, die Genomsequenz verschiedener Organismen vollständig zu entschlüsseln. Die Verfügbarkeit vollständiger genomischer Daten löste die Entwicklung von modernen Hochdurchsatzmethoden aus, welche die gleichzeitige Messung von verschiedenen Transkripten, Proteinen und Metaboliten erlauben. Mittels genomischer Informationen und Hochdurchsatztechnologien erlaubt eine hoch parallelisierte experimentelle Biologie die Erforschung von Gesetzmäßigkeiten, welchen biologischen Systemen zugrunde liegen. Das Verständnis biologischer Komplexität durch Modellierung zellulärer Systeme repräsentiert die treibende Kraft, welche heutzutage den Element-zentrierten Focus auf integrative und ganzheitliche Untersuchungen lenkt. Das sich entwickelnde Feld der Systembiologie integriert Entdeckungs- und Hypothesen-getriebene Wissenschaft um ein umfangreiches Wissen durch Computermodelle biologischer Systeme bereitzustellen.<br><br> Im Kontext der sich neu entwickelnden Systembiologie investierte ich in umfangreiche Computeranalysen zur Transkript Co-Response bezüglich ausgewählter prokaryotischer und pflanzlicher eukaryotischer Organismen. CSB.DB - a comprehensive systems-biology database - (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/) wurde initiiert, um freien Zugang zu den biostatistischen Ergebnissen als auch zu weiterem biologischem Wissen zu bieten. Die Datenbank CSB.DB ermöglicht potentiellen Anwendern die Hypothesengenerierung bezüglich der funktionalen Wechselbeziehungen von Genen von Interesse und kann zukünftig die Grundlage für einen fortgeschrittenen Weg der Zuordnung von Genfunktionen darstellen. Unter Verwendung chromosomaler Distanzen und Transkript Co-Response konnte das Konzept und CSB.DB angewandt werden, um bakterielle Operons in Escherichia coli erfolgreich vorherzusagen. Darüber hinaus werden Beispiele gezeigt, die andeuten, dass die Transkript Co-Response Analyse eine Identifizierung differentieller Promoteraktivität in verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglicht. Das Co-Response Konzept wurde, mit dem Schwerpunkt auf die eukaryotische Modellpflanze Arabidopsis thaliana, erfolgreich auf komplexere Organismen angewandt. Die durchgeführten Untersuchungen ermöglichten die Identifizierung neuer Gene hinsichtlich physiologischer Prozesse und darüber hinaus die Zuweisung von Genfunktionen, welche nicht durch Sequenzhomologie ermöglicht werden kann. GMD - The Golm Metabolome Database - wurde initiiert und in CSB.DB implementiert, um Metaboliten Informationen als auch Metaboliten Profile zu integrieren. Dieses neue Modul ermöglicht die Ausrichtung auf komplexere biologische Fragen und erweitert die derzeitige systembiologische Fragestellung in Richtung Phänotypus-Zuordnung.