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Previous issue date: 2013-11-21 / Citrus Black Spot (CBS) caused by Guignardia citricarpa is classified as
quarantine disease, imposing restrictions to fresh fruits shipping to the European Union
countries. In the state of Goiás, despite systematic phytosanitary surveys, its distribution
and occurrence are unknown due to lack of available technologies for diagnosis. The
occurrence of latent infections, the presence of an endophytic species morphologically
similar to G. citricarpa, as well as time consuming for diagnosis through conventional
methods require the validation of fast, efficient, reproducible, safe and sensitive methods
of diagnosis to provide reliability of diagnosis and disease surveys for its detection and
delimitation. Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide”
method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation
of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for
further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of
DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL
-1
and
322.79 ng µL
-1
, respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The
extractor of DNA in amount (>300 ng µL
-1
) and quality (structural integrity) was sufficient
to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was
demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA
(event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region
of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and
partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of
variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method
for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was
validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time
PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR
presented detecting limit of 10 ng µL
-1
of the fungus DNA, with repeatability. Real time
PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique
with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24
external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight
from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB
method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low
concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when
we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to
be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10
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DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples;
being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é
considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas
para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos
fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da
tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de
uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para
o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos
moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que
garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação
da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl
trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos
de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e
ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico
por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na
quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados
(328,62 ng µL
-1
e 322,79 ng µL
-1
, respectivamente), com baixa concentração de proteínas
na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL
-1
) e qualidade
(integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e
PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em
tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento
MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento
em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e
reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando
coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005,
foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e
PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos
de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados
para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de
10 ng µL
-1
de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior
sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade,
na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas
externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e
superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o
método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada
em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional.
Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente
sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas,
constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares
assintomáticos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/4005 |
| Date | 21 November 2013 |
| Creators | Faganello, Fernanda de Sillos |
| Contributors | Cunha, Marcos Gomes da, Coelho, Regina Melo Sartori, Cunha, Marcos Gomes da, Lobo Junior, Murillo, Coelho, Regina Melo Sartori, Fenille, Roseli Chela |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Agronomia (EAEA), UFG, Brasil, Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos - EAEA (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 842119561133988381, 600, 600, 600, 4500684695727928426, -150886911456562212 |
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