Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-05Bitstream added on 2014-06-13T19:58:04Z : No. of bitstreams: 1 motta_rr_me_jabo.pdf: 906417 bytes, checksum: 313df4fc7f074ff43b3f9ee2d69280ca (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho teve como objetivos monitorar a quantidade de resíduo existente em frutos de laranjeira ‘Valência’ dos fungicidas oxicloreto de cobre, tiofanato metílico e pyraclostrobin, como também determinar a capacidade protetora e fungistática (oxicloreto de cobre) e a capacidade preventiva e curativa (tiofanato metílico e pyraclostrobin) no controle da mancha preta dos frutos cítricos (MPC). No primeiro experimento, aproximadamente 1000 frutos, previamente ensacados, foram primeiramente imersos nas caldas fungicidas e posteriormente inoculados com conídios de Guignardia citricarpa em intervalos regulares de 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a aplicação do fungicida, para o oxicloreto de cobre e de 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias após a aplicação do fungicida, para o tiofanato metílico e pyraclostrobin. No segundo experimento, aproximadamente 1000 frutos, previamente ensacados, foram primeiramente inoculados e posteriormente tratados por imersão com os respectivos fungicidas nos mesmos intervalos regulares. Foram utilizados 16 frutos por período de inoculações e oito frutos por período de aplicação do fungicida. Para o primeiro experimento, oito frutos foram utilizados para a realização das análises de resíduo e outros oito frutos deixados na planta até a época da colheita. Para o segundo experimento, somente avaliou-se a incidência da doença e severidade na colheita. As análises de resíduos foram realizadas por técnicas de Espectrofotometria de Absorção Atômica na superfície dos frutos, para o oxicloreto de cobre e de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao detector de massas/massas (CLAE - EM/EM) na superfície e casca dos frutos, para o tiofanato metílico e na superfície, casca e polpa dos frutos para o pyraclostrobin. Na época da colheita, os frutos foram avaliados quanto à incidência, severidade... / The objectives of this study were: (i) measure the amount of residues of copper oxychloride, methyl thiophanate and pyraclostrobin in 'Valencia’ sweet orange fruits after their application; (ii) to evaluate the protective and fungistatic capacity of copper oxychloride and (iii) to evaluate the preventive and curative capacity of systemic fungicides methyl thiophanate and pyraclostrobin for the control of citrus black spot (CBS). Two experiments were carried out, in the first on 1.000 fruits were first immersed in the fungicides and then inoculated with conidia of Guignardia citricarpa at regular intervals of 1, 7, 14, 21, 28 and 35 days, for the copper oxychloride and 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 and 56 days for methyl thiophanate and pyraclostrobin. In the second experiment, on 1.000 fruits were first inoculated with conidia of G. citricarpa and then treated by immersion with the fungicides in the same regular intervals as described. Sixteen fruits were used for each period of inoculations and eight fruits per application. For the first experiment, eight fruits were used for analysis of residues and eight fruits were left in the plant until harvesting to evaluate disease incidence and severity. For the second experiment it was evaluate only disease incidence and severity in the harvest. Analysis of residues were performed by Atomic Absorption Spectrometry on the fruits surface, for copper oxychloride and High Performance Liquid Chromatography coupled to the detector mass/mass (HPLC - MS / MS) on the fruits surface and peel for the methyl thiophanate, and on the fruits surface, peel and pulp for the fungicide pyraclostrobin. Under conditions of high inoculum pressure, copper oxychloride showed limited protective capacity and no fungistatic capacity. Residues found on the fruits surface were directly related to the fruits growth. Methyl thiophanate was converted on its metabolite... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:55:46Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Citrus Black Spot (CBS) caused by Guignardia citricarpa is classified as quarantine disease, imposing restrictions to fresh fruits shipping to the European Union countries. In the state of Goiás, despite systematic phytosanitary surveys, its distribution and occurrence are unknown due to lack of available technologies for diagnosis. The occurrence of latent infections, the presence of an endophytic species morphologically similar to G. citricarpa, as well as time consuming for diagnosis through conventional methods require the validation of fast, efficient, reproducible, safe and sensitive methods of diagnosis to provide reliability of diagnosis and disease surveys for its detection and delimitation. Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL -1 and 322.79 ng µL -1 , respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µL -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µL -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µL -1 e 322,79 ng µL -1 , respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µL -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos.