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Previous issue date: 2016-09-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The main purpose of this study was to assess conformational changes in preselected aptamers A03 and C10 against untranslated regions present in the genome of the dengue virus (DENV), by means of molecular biology and physics assays. Aptamers are nucleic acid molecules with potential theranostic applications. In this context, dengue was the target chosen for study because is an important infectious viral disease presenting high rates of morbidity and mortality in the worldwide, especially in tropical and subtropical areas, where there are high incidences of the mosquito vector Aedes aegypti. These aptamers showed, by dot-blot and magnetic beads ligand capture and subsequent qPCR detection, similar affinities and specificities to binding to the DENV 5'UTR. Probably, the analogy of the motifs and secondary structures presented in these ligands, identified by in silico studies, are responsible for these similarities. Data obtained by using Fluorescence Resonance Energy Transfer Assays (FRET) confirmed the affinity of A03 as DENV ligand by conformational changes in the double labeled aptamer (5’-FAM, 3’-TAMRA). Aptamer conformacional changes resulting from its interaction with the target were detected by the modifications in the fluorescence intensities between FAM and TAMRA fluorophores. These conformational changes results in donor-acceptor distance modification that has an effect on FRET efficiency and on fluorescence intensity of these molecules. The ionic strength of the buffer used in the trials had significant influence on the conformation of the aptamer, allowing the detection of interactions between A03 and DENV. The ions in the buffer lead an effect in the conformation of the aptamer, increasing its thermal stability, and the Mg2+ ion has led to major conformational changes on A03 compared to Na+ ion. The data presented herein demonstrated the importance of the studies of oligonucleotides binding affinity and specificity to Dengue virus. It can be concluded that the A03 and C10 aptamers have potential in application for diagnostic and/or therapeutic purposes, considering the diluent buffer, since different salts have influence on the secondary and tertiary conformational structures of aptamers, and on bioavailability of interaction with the target. / O objetivo principal desse trabalho foi avaliar alterações conformacionais nos aptâmeros A03 e C10 previamente selecionados contra regiões não traduzidas presentes no genoma do vírus da dengue (DENV), por meio de testes de biologia e física molecular. Os aptâmeros são moléculas de
ácidos nucleicos com potencial aplicação na teranóstica das mais diversas doenças. Nesse contexto, destaca-se a dengue, uma doença infecciosa viral com altos índices de morbi-mortalidade em um cenário mundial, principalmente em regiões tropicais e subtropicais, onde são altas as incidências do mosquito vetor Aedes aegypti. Esses aptâmeros demonstraram, por meio de dot blot e de captura de ligantes por beads magnéticos com detecção por PCR em Tempo Real, afinidades e especificidades semelhantes de ligação à 5’UTR do DENV. Provavelmente, essas semelhanças se deram em função dos motivos e das estruturas secundárias análogas apresentadas por esses ligantes, obtidas por ensaios in silico. Os ensaios de Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência (FRET) permitiram a confirmação dessa afinidade de ligação entre A03:DENV, devido às alterações estruturais ocorridas no aptâmero duplamente marcado em sua sequência (5’-FAM; 3’-TAMRA). As alterações conformacionais no aptâmero resultantes de sua interação com o alvo foram detectadas pelas mudanças nas intensidades de fluorescência do FAM e do TAMRA, decorrentes de alterações nas distâncias entre o doador e o aceitador que afetam a eficiência FRET e por conseguinte as intensidades de fluorescência destas moléculas. A força iônica do tampão utilizado nos ensaios apresentou importante influência na conformação do aptâmero, permitindo a detecção das interações entre A03 e o DENV. Os íons presentes na solução tampão afetaram a conformação estrutural do aptâmero e aumentaram sua estabilidade térmica, sendo que o íon Mg2+ levou a maiores alterações estruturais sobre o A03 comparado ao íon Na+. Os dados aqui apresentados demostraram a importância dos estudos de afinidade e especificidade dos oligonucleotídeos ligantes ao vírus da dengue. É possível concluir que os aptâmeros A03 e C10 apresentam potencial de aplicação para fins diagnósticos e/ou terapêuticos, considerando o tampão diluente, uma vez que os diferentes sais presentes exercem influência sobre as estruturas conformacionais secundárias e terciárias dos aptâmeros, e em sua biodisponibilidade de interação com o alvo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/6434 |
| Date | 02 September 2016 |
| Creators | Arruda, Rívia Aparecida Reinalda |
| Contributors | Neves, Adriana Freitas, Souza, Eduardo Sérgio de, Neves, Adriana Freitas, Lacerda, Elisângela de Paula Silveira, Santos, Maria Rita de Cássia |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Química (RC), UFG, Brasil, Regional Catalão (RC) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -6339953996062715594, 600, 600, 600, 600, 6665988530194015545, 1571700325303117195, 2075167498588264571 |
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