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Previous issue date: 2015-02-12 / CNPq / Este trabalho objetivou obter proteases com propriedades colagenolíticas a partir dos resíduos de três espécies de peixes neotropicais (arabaiana Seriola dumerili; pescada-branca Cynoscion leiarchus; e tucunaré Cichla ocellaris), através de extração por sistema de duas fases aquosas (SDFA), visando aplicá-lo para produção de peptídeos de colágeno. Inicialmente, serino proteases foram extraídas e caracterizadas físico-quimicamente quanto à temperatura e pH ótimos, bem como estabilidade à variação desses parâmetros e verificação de seus parâmetros cinéticos (Km e Vmáx). A sensibilidade aos íons metálicos e aos inibidores naturais e sintéticos também foi avaliada. Em seguida, a atividade colagenolítica dos extratos foi mensurada, obtendo-se 106,82 U/mg (C. ocellaris), 42,44 U/mg (S. dumerili) e 98,08 U/mg (C. leiarchus). Nos testes com inibidores de serino (PMSF) e metaloproteases (EDTA) obteve-se 18,53 e 23,29 U/mg, 14,09 e 14,94 U/mg e de 37,45 e 15,55 U/mg, como atividades enzimáticas de C. ocellaris, S. dumerili e C. leiarchus, respectivamente. Proteases com propriedades colagenolíticas de C. leiarchus e de C. ocellaris obtiveram pH ótimo de 8,0 e 7,5, mantendo-se estável entre 6,5 e 11,5; temperatura ótima de 55°C, termoestável entre 25 e 60°C, respectivamente. Os íons Ca2+ e Mg2+ funcionaram como ativadores, enquanto Zn2+ e Pb2+ atuaram como inibidores, assim como a ação da Benzamidina e TLCK, inibidores específicos de tripsina. No teste de especificidade ao colágeno, a enzima de C. leiarchus, após 48 horas, clivou todos os tipos de colágeno testados, sendo eficaz na seguinte ordem: colágeno da pele de P. corruscans > colágeno da pele de O. niloticus > colágeno bovino tipo I; enquanto que, para a enzima de C. ocellaris, após 36 horas, colágeno tipo I > colágeno de pele de P. corruscans > colágeno de pele de O. niloticus. As características físico-químicas da colagenases de C. ocellaris mostraram-se mais interessantes para prosseguimento das análises. Dessa forma, foram obtidos o Km e o Vmáx como 5,92 mM e 294,40 U/mg, respectivamente. Esta enzima mostrou especificidade aos colágenos testados, durante o intervalo de 1 h a 55°C, na seguinte condição: colágeno tipo I > colágeno de pele de O. niloticus > colágeno de pele de P. corruscans. A colagenase intestinal de C. ocellaris foi recuperada por meio do sistema de duas fases aquosas (SDFA) para obtenção da enzima purificada, obtendo-se coeficiente de partição de 8.24, usando 20,0% (w/w) de PEG 8000 e 12,5% (w/w) de sal de fosfato a pH 8,0. A enzima PEG-colagenolítica ainda foi capaz de clivar o colágeno do tipo I e do colágeno extraído da pele de C. ocellaris (rendimento 2.9% de peso seco). A técnica de SDFA permitiu a remoção de contaminantes por um processo rápido, simples e econômico e funcionou como etapa principal de purificação capaz satisfazer a necessidade de isolamento para a produção de peptídeos de colágeno, como descritos no presente trabalho. A simplicidade e alto rendimento, somando investimentos mais baixos, tornam o SDFA uma opção promissora de extração de colagenases a partir de resíduos do processamento do pescado para a produção de peptídeos de colágeno, visando aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e de cosméticos. / This study aimed to obtain proteases with collagenolytic properties from the waste of three species of Neotropical fish (greater amberjack Seriola dumerili; hake Cynoscion leiarchus, and peacock bass Cichla ocellaris), through extraction by aqueous two-phase system (ATPS), to apply it in the production of collagen peptides. Initially, serine proteases were extracted and physicochemically characterized for optimum temperature and pH, as well as stability to the variation of these parameters and verification of its kinetic parameters (Km and Vmax). The sensitivity to the metal ions and natural and synthetic inhibitors was also assessed. Then, the collagenolytic activity of the extracts was measured, yielding 106.82 U/mg (C. ocellaris), 42.44 U/mg (S. dumerili) and 98.08 U/mg (C. leiarchus). Tests with inhibitors of serine (PMSF) and metalloproteinases (EDTA) yielded 18.53 and 23.29 U/mg, 14.09 and 14.94 U/mg and 37.45 and 15.55 U/mg such as enzymatic activities of C. ocellaris, S dumerili and C. leiarchus, respectively. Collagenolytic proteases with collagenolytic properties from C. leiarchus and C. ocellaris obtained optimum pH of 8.0 to 7.5, and is stable between 6.5 and 11.5; optimum temperature 55°C, thermostable between 25 and 60°C, respectively. Ca2+ and Mg2+ functioned as activators and Zn2+, and Pb2+ acted as inhibitors, as well as the action of Benzamidine and TLCK, specific inhibitors of trypsin. In the collagen specificity test enzyme of C. leiarchus, after 48 hours, cleaved all collagen types tested being effective in the following order: P. corruscans skin collagen > O. niloticus collagen skin > bovine collagen type I; while for the enzyme from C. ocellaris, after 36 hours, type I collagen > P. corruscans skin collagen > O. niloticus skin collagen. The physicochemical characteristics of the collagenase of C. ocellaris were more interesting for further analysis. Thus, there was obtained a Michaelis-Menten constant (Km) and Vmax, 5.92 mM and 294.40 U/mg, respectively. The enzyme was specific to the tested collagens, during the interval of 1 h at 55°C in the following condition: type I collagen > O. niloticus skin collagen > P. corruscans skin collagen. The intestinal collagenase C. ocellaris was recovered by means of aqueous two-phase system (ATPS) to obtain the enzyme purified to give 8.24 partition coefficient, using 20.0% (w/w) PEG 8000 and 12.5% (w/w) of pH 8.0 phosphate salt. PEG-collagenolytic enzyme was still able to cleave collagen type I and collagen extracted from skin of C. ocellaris (yield 2.9% dry weight). The ATPS allowed the removal of contaminants by a fast, simple and cost effective technique and worked as main stage of purification, meeting the need for isolation, as in the production of collagen peptides, as described in this work. The simplicity and high performance, adding lower investments, make the ATPS a promising option collagenase extraction from waste from the fish processing for the production of collagen peptides, aiming at application in the food industry, pharmaceutical and cosmetics.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/14976 |
| Date | 12 February 2015 |
| Creators | OLIVEIRA, Vagne de Melo |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/4989617783837981, PORTO, Ana Lúcia Figueiredo, BEZERRA, Ranilson de Souza |
| Publisher | UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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