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Dissertação Anna LíviaFINALIZADA E COM FICHA.pdf: 4755413 bytes, checksum: 4691e65d161267ed8769212d59e3b396 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-16T16:55:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2
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Previous issue date: 2015-02-26 / FACEPE / Ensaios baseados em fluorescência possuem alta sensibilidade, o que pode proporcionar a identificação e quantificação de biomoléculas e ajudar a elucidar diversos eventos celulares. O desenvolvimento de novas sondas fluorescentes, tais como os Quantum Dots (QDs), tem permitido aos pesquisadores usufruir de todo o potencial de fluorescência. QDs são nanopartículas de materiais semicondutores, de 2 a 10 nm, que possuem características ópticas únicas, tais como fotoestabilidade. Todavia sua utilização no estudo intracelular ainda é limitada, pois sua passagem através da membrana celular não se dá passivamente, ficando preso em vesículas endocíticas, necessitando assim de um método que realize a sua entrega livre no citosol. Dentre algumas metodologias já descritas para entrega intracelular de QDs destacam-se a eletroporação, microinjeção e a fixação celular. Todavia, essas apresentam algumas desvantagens, sendo metodologias laboriosas ou danosas às células. Dentro dessa realidade os lipossomas fusogênicos aparecem como uma ferramenta capaz de sanar essas desvantagens, por serem vesículas de bicamadas lipídicas que podem se fundir às células liberando seu conteúdo no citosol. Assim, neste trabalho teve-se como objetivo desenvolver dois métodos utilizando lipossomas para carrear QDs hidrofílicos ao interior de células vivas. Primeiramente QDs de CdTe aniônicos foram encapsulados em lipossomas de fosfatidilcolina, catiônicos (contendo DOTAP) e fusogênicos (contendo DOPE, DOTAP e DPPE-Rh). A análise por microscopia de fluorescência de hemácias e células tronco incubadas com os lipossomas fusogênicos contendo os QDs negativos, evidenciou que os QDs ficaram ligados à membrana celular devido à diferença de cargas negativas dos QDs e positivas dos lipídeos. Portanto, na continuidade deste trabalho uma segunda abordagem, baseada na método de injeção em etanol, foi desenvolvida para a encapsulação de QDs e aplicada para os mesmos tipos de lipossomas anteriormente descritos. Nessa segunda metodologia, os QDs de CdTe positivos foram também utilizados, de forma a evitar a interação eletrostática entre os QDs e os lipídeos. Para ambos os métodos desenvolvidos, os lipossomas foram caracterizados por medidas de potencial zeta, de raio hidrodinâmico, microscopia de fluorescência e eletrônica de transmissão, confirmando que houve a encapsulação de QDs para todos os sistemas lipossomais utilizados. Ao longo de todo o estudo as hemácias foram células modelo importantes para avaliar a fusão dos lipossomas com a membrana celular, pois estas não apresentam atividade endocítica. Os lipossomas de fosfatidilcolina e catiônicos serviram de modelo para desenvolver as duas metodologias de encapsulação que posteriormente foram aplicadas aos fusogênicos. Os estudos feitos com hemácias e células HeLa, utilizando a segunda metodologia de encapsulação e lipossomas fusogênicos, sugerem a entrega dos QDs positivos nas células vivas. No entanto, estudos adicionais precisam ser desenvolvidos para comprovar se os QDs positivos se encontram livres ou não no citosol. Este novo método apresenta ainda potencialidade para a encapsulação de QDs bioconjugados, pois o processo de congelamento do anterior poderia desnaturar as proteínas. Esperamos que este estudo possa ajudar no desenvolvimento de métodos efetivos de liberação de QDs no citosol, de forma que seja possível se utilizar as vantagens dessas sondas fluorescentes para melhor compreender vários processos intracelulares. / Fluorescence-based assays have high sensitivity, which can provide the identification and quantification of biomolecules and help elucidate cellular events. The development of new fluorescent probes such as Quantum Dots (QD) has enabled researchers to take advantage of the full fluorescence potential. QDs are semiconductor nanoparticle materials from 2 to 10 nm which have unique optical properties such as photostability. However, their use in intracellular study is limited because its passage through the cell membrane does not occur passively, getting stuck in endocytic vesicles, thus requiring a method to conduct their free delivery in the cytosol. Among some methods already described for the intracellular delivery of the QDs include electroporation, microinjection and cell attachment. However, these have disadvantages, like being laborious methods or damaging the cells. Within this reality, the fusogenic liposomes appear as a tool to solve these drawbacks, being vesicles of lipid bilayers that can merge the cells releasing its contents into the cytosol. Thus, this study was aimed to develop two methods using liposomes to adduce hydrophilic QDs inside living cells. First of anionic CdTe QDs were encapsulated in phosphatidylcholine liposomes, cationic (containing DOTAP) and fusogenic (containing DOPE, DOTAP and DPPE-Rh). Analysis by fluorescence microscopy of stem cells and red blood cells incubated with the fusogenic liposomes containing the negative QDs, the QDs showed that they were bound to the cell membrane due to the difference of negative and positive charges of QDs and lipids, respectively. Therefore, the continuation of this work a second approach based on the ethanol injection method has been developed for encapsulating and implemented QDs for the same types of liposomes described above. In this second method, the positive CdTe QDs were also used in order to prevent electrostatic interaction between the lipid and the QDs. For both developed methods, the liposomes were characterized by zeta potential measurements, hydrodynamic radius, fluorescence microscopy and transmission electron confirming that there was encapsulating QDs for all liposomal systems used. The study with red blood cells were important to assess the fusion of the liposomes with the cell membrane, because they do not have the endocytic activity. The cationic and the phosphatidylcholine liposomes served as a model to develop methods for encapsulation, and subsequently applied to the fusogenic. Studies done with red blood cells and HeLa cells using the second method of encapsulation and fusogenic liposomes, suggest delivery of positive QDs in living cells. However, additional studies are needed to see if the positive QDs are free or not in the cytosol. This new method also has potential for encapsulating QDs bioconjugates because the freezing process, used before, may denature proteins. We hope that this study may help in the development of effective methods of QDs release in the cytosol, so being possible to use the full advantages of these fluorescent probes to better understand several intracellular processes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/15163 |
| Date | 26 February 2015 |
| Creators | MATOS, Anna Lívia Linard |
| Contributors | FONTES, Adriana |
| Publisher | UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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