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Previous issue date: 2015-02-27 / FACEPE / A utilização de sistemas de liberação controlada de fármacos de base nanotecnológica, a exemplo dos lipossomas, representa atualmente um grande avanço no tratamento e diagnóstico de várias doenças. Modificações na superfície desses nanossistemas vêm sendo foco nas pesquisas, com objetivo de maximizar a eficácia e segurança dos mesmos, a partir do desenvolvimento de sistemas de longa circulação e/ou sítio-específicos. Neste trabalho, a fucana, um polissacarídeo sulfatado, foi utilizada como molécula de revestimento da superfície de lipossomas, uma vez que apresenta duas propriedades importantes: a capacidade de não ativar o sistema complemento, e a de ser reconhecida e poder se ligar à receptores encontrados na superfície de macrófagos. Essas duas propriedades nos encorajaram a utilizar a fucana com o propósito de desenvolver um novo sistema lipossomal de longa circulação e direcionado para macrófagos. Assim, a primeira etapa deste estudo envolveu uma síntese química, na qual a fucana foi modificada quimicamente por meio de sua conjugação com o colesterol (fucana hidrofobizada), através de um novo procedimento de irradiação por micro-ondas. Posteriormente, lipossomas revestidos com fucana contendo ácido úsnico foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico, variando as quantidades de fucana hidrofobizada. Os lipossomas foram caracterizados por determinação do tamanho da partícula, índice de polidispersão (PDI), carga de superfície (ζ) e eficiência de encapsulação do fármaco. Além disso, os lipossomas foram avaliados em estudos in vitro de citotoxicidade, captura celular e pelo método de competição de inibidores por receptores específicos frente a macrófagos RAW 264.7. Por fim, a atividade antimicobacteriana e interações entre fármacos foram avaliada pelo método chekerboard contra isolados de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes. Os resultados obtidos evidenciaram que a fucana modificada quimicamente foi capaz de ser utilizada no desenvolvimento de lipossomas revestidos. Observou-se que a variação da quantidade de fucana de 5 para 20 mg promoveu um aumento no tamanho e no PDI das vesículas de 168 ± 2,82 nm, 0,36 para 1,18 ± 0,01μm, 0,46, respectivamente. Por outro lado, com o aumento da concentração de fucana, o ζ diminuiu (1,35 ± 0,185 mV para -5,41 ± 0,234 mV), visto que a mesma é um polissacarídeo negativo. Em relação à taxa de encapsulação, todas as formulações apresentaram valor superior a 98% indicando que o revestimento com fucana não alterou a encapsulação do ácido úsnico. Os estudos de citotoxicidade revelaram que as formulações lipossomais revestidos com fucana, exibiram valores de IC50 inferiores (12.70 ± 1,56μM) em comparação aos lipossomas sem revestimento IC50= 18,37 ± 3,24 μM). Em relação à captura celular, os resultados mostraram que os lipossomas revestidos foram capturados de forma mais rápida (15 min) que os lipossomas sem revestimentos (60 min) podendo sugerir que foram mais rapidamente reconhecidos pelos macrófagos. Adicionalmente, os resultados obtidos no experimento de inibidores competitivos sugerem que os lipossomas revestidos pela fucana (Lipofuc5) foram internalizados através do “scavenger receptors” (SR) presente na superfície dos macrófagos. Nos estudos utilizando isolados de M. tuberculosis multirresistentes, a encapsulação do ácido úsnico em lipossomas potencializou a atividade antimicobacteriana deste composto liquênico, além de apresentar um efeito sinérgico com a ripamficina. Esses sistemas apresentam, portanto, um potencial como candidatos à melhoria da atividade antimicobacteriana da rifampicina. Diante do exposto, os lipossomas revestidos com fucana contendo ácido úsnico apresentam-se como uma alternativa para o direcionamento eficiente de fármacos aos macrófagos. / The use of controlled drug delivery systems, such as liposomes, currently represents a major advance in the treatment and diagnosis of various diseases. Changes in the surface of these nanosystems have been focusing on research, aiming to maximize their effectiveness through the development of stealth or site-specific systems. In this work, the fucoidan, a sulfated polysaccharide, was used for coating liposomes, since it presents two important properties: the ability to not activate the complement system and of being recognized and bound by receptors found on macrophages. These two activities have encouraged us to use the fucoidan for the purpose of developing a new long-circulating liposomal system and directed to macrophages. Thus, the first stage of the study involved a synthesis, wherein the fucoidan was chemically modified by conjugating with cholesterol through a new microwave irradiation procedure. Subsequently, fucoidan-coated liposomes containing usnic acid were prepared by lipid film hydration method and varying the amounts of hydrophobized fucan. Liposomes were characterized by determining particle size (Ø), polydispersity index (PDI), surface charge (ζ) and drug encapsulation efficiency. Finally, liposomes have been evaluated in vitro study of cytotoxicity, cellular uptake and competition assay using RAW 264.7. In addition the antimycobacterial activity and interactions between the drugs were evaluated through chekerboard method against multidrug resistant strains of M. tuberculosis. The results showed that (hydrophobized fucoidan) were able to be used in the development of coated liposomes. It was observed that by varying the amount of fucoidan from 5 to 20 mg, an increase in size and PDI of the vesicles from 168 ± 2.82nm, 0.36 and 1.18 ± 0.01μm, 0.46, was found respectively. Moreover, with the increase in fucoidan concentration the ζ lower (1.35 ± 0.185 ± 0.234 -5.41 mV mV), due to its negative charges exposed to the surface of liposomes. Regarding drug encapsulation efficiency, all formulations showed greater than 98% value, indicating that the coating did not affect the encapsulation of usnic acid. In relation to cellular uptake, the results showed that the fucan coated liposomes were captured faster (15 min) as compared with uncoated liposomes (60 min), suggesting that were quickly recognized by macrophages. In addition, the results obtained in the experiments of competitive inhibitors suggested that the coated liposomes (Lipofuc5) were internalized through C-type carbohydrate recognition domain present in the scavenger receptors (SR). In studies using multidrug resistant M. tuberculosis isolates, the encapsulation of usnic acid into liposomes enhanced the antimycobacterial active both in the free and encapsulated forms. In this way, usnic acid may be candidates for improving the antimycobacterial activity of rifampicin. Given the above, fucoidan-coated liposomes containing usnic acid are an alternative approach for targeting efficiently drugs to macrophages.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/15334 |
| Date | 27 February 2015 |
| Creators | CARVALHO, Rafaela de Siqueira Ferraz |
| Contributors | MAGALHÃES, Nereide Stela Santos |
| Publisher | UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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