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Previous issue date: 2015-02-27 / CNPQ / Frutos da romãzeira (Punica granatum L.) são usados popularmente para tratar infecções
causadas por microorganismos. Este trabalho descreve o isolamento da lectina da sarcotesta
de P. granatum (PgTeL; P. granatum testa lectin) através de extração de proteínas utilizando
NaCl 0,15 M, fracionamento salino utilizando sulfato de amônio (30 % de saturação) e
cromatografia em coluna de quitina. A atividade hemaglutinante (AH) foi monitorada ao
longo do processo de purificação utilizando eritrócitos de coelho. A massa molecular de
PgTeL nativa foi determinada por cromatografia de gel filtração e o perfil eletroforético em
condições desnaturantes foi avaliado em gel de poliacrilamida contendo sulfato sódico de
dodecila (SDS-PAGE). Os efeitos do pH, temperatura e íons sobre a sua AH foram
determinados e a atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos de importância médica
foi avaliada através da determinação das concentrações mínima inibitória (CMI), mínima
bactericida (CMB) e mínima fungicida (CMF). Ainda, foi avaliado o efeito de PgTeL na
capacidade de aderência e invasiva de bactérias em células HeLa. Tratamento do extrato que
apresentou HA específica (18,3) da sarcotesta com sulfato de amônio resultou na precipitação
de contaminantes proteicos, uma vez que a fração sobrenadante (FS 30%) apresentou maior
AH específica (782) que a fração de proteínas precipitadas (13,92). O perfil da cromatografia
de FS 30% em coluna de quitina apresentou um único pico proteico adsorvido, que foi eluído
com ácido acético 1,0 M e, após diálise, aglutinou eritrócitos, correspondendo a PgTeL (AH
específica: 19.430). A massa molecular relativa de PgTeL nativa em cromatografia de gel
filtração foi 58 kDa. Em SDS-PAGE, PgTeL apresentou uma única banda polipeptídica de 58
kDa, indicando que sua estrutura não é formada por subunidades unidas por ligações nãocovalentes.
A AH de PgTeL foi detectada em valores de pH de 5,0 a 8,0 e foi resistente ao
aquecimento até 100°C durante 30 minutos. A AH de PgTeL foi estimulada por Ca2+ (10
mM) e Mg2+ (20 mM). PgTeL foi agente bacteriostático e bactericida contra Aeromonas sp.,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis, Serratia
marcescens, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus mutans (valores de CMI variando
de 0,27 a 9,0 μg/mL e CMB de 0,27 a 68,4 μg/mL), enquanto apenas inibiu o crescimento de
Klebsiella sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis (valores de CMI
variando de 16 a 20 μg/mL). PgTeL também inibiu a capacidade de aderência de S. enteritidis
(40% de inibição) e a capacidade invasiva de E. coli e S. aureus (59% e 25% de inibição
respectivamente) em células HeLa. PgTeL mostrou atividade antifúngica contra espécies de
Candida (com CMI variando de 6,25 a 25 μg/mL e CMF variando de 6,25 a 50 μg/mL). Em
conclusão, PgTeL é uma lectina ligadora de quitina, termoestável, ativa em ampla faixa de pH
e com ação antibacteriana e antifúngica, bem como é capaz de interferir na aderência e
capacidade invasiva bacteriana. / Fruits of pomegranate (Punica granatum L.) are used by people to treat infections caused by
microorganisms. This work reports the isolation of a lectin from P. granatum sarcotesta
(PgTeL) by protein extraction using 0.15 M NaCl, saline fractionation using ammonium
sulfate (30% saturation) and chromatography on chitin column. Hemagglutinating activity
(HA) was monitored during the purification process using rabbit erythrocytes. The molecular
mass of native PgTeL was determined by gel filtration chromatography and the
electrophoretic profile under denaturing conditions was evaluated using polyacrylamide gel
containing sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE). The effects of pH, temperature and ions on
its HA were determined and the antimicrobial activity against bacteria and fungi with medical
importance was evaluated by determination of minimal bactericide (MBC), inhibitory (MIC)
and fungicide (MFC) concentrations. In addition, it was evaluated the effect of PgTeL on the
adherence and invasive abilities of bacteria on HeLa cells. Treatment of the sarcotesta extract
which showed specific HA (18.3) with ammonium sulphate resulted in precipitation of proteic
contaminants since the supernatant fraction (SF 30%) showed highest specific HA (782) than
the precipitated protein fraction (13.92). Chromatography profile of SF 30% on chitin column
showed a single adsorbed protein peak, which was eluted with 1.0 M acetic acid and, after
dialysis, agglutinated erythrocytes, corresponding to PgTeL (specific HA: 19.430). The
relative molecular mass of native PgTeL on gel filtration chromatography was 58 kDa. In
SDS-PAGE, PgTeL appeared as a single polypepetide band with 58 kDa, indicating that its
structure is not composed by subunits linked by non-covalent interactions. The HA of PgTeL
was detected at pH values from 5.0 to 8.0 and was resistant to heating at 100°C for 30
minutes. The HA of PgTeL was stimulated by Ca2+ (10 mM) and Mg2+ (20 mM). PgTeL was
bacteriostatic and bactericide agent against Aeromonas sp., Enterococcus faecalis,
Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens,
Staphylococcus saprophyticus and Streptococcus mutans (MIC values ranging from 0.27 to
9.0 μg/mL and MBC from 0.27 to 68.4 μg/mL) while only inhibited the growth of Klebsiella
sp., Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis (MIC values ranging from 16 to
20 μg/mL). PgTeL also inhibited the adherence ability of S. enteritidis (40% inhibition) and
invasive ability of E. coli and S. aureus (59% and 25% inhibition respectively) on HeLa cells.
PgTeL showed antifungal activity against Candida species (MIC values ranging from 6.25 to
25 μg/mL and MFC ranging from 6.25 to 50 μg/mL). In conclusion, PgTeL is a thermostable
and chitin-binding lectin, active at a broad pH range, and with antibacterial and antifungal
action, as well as is able to interfere with adherence and invasivive abilities of bacteria.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/15432 |
| Date | 27 February 2015 |
| Creators | SILVA, Pollyanna Michelle da |
| Contributors | PAIVA, Patricia Maria Guedes, GOMES, Francis Soares |
| Publisher | UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, Programa de Pos Graduacao em Bioquimica e Fisiologia, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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