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Previous issue date: 2015-02-23 / FACEPE / As proteases são enzimas proteolíticas, as quais apresentam grande interesse pelas indústrias em diversas áreas. As proteases que possuem a capacidade de degradação da hélice de colágeno tem sido estudadas para a aplicação dos peptídeos de colágeno, no tratamento de doenças como: hipertensão, inibindo a enzima conversora de angiotensina II (ECA), assim como da própria enzima pelas indústrias farmacêuticas em tratamentos de feridas com necrose ou no tratamento da doença de Dupuytren. As proteases com atividade colagenolítica, capazes de degradar o colágeno, podem ser obtidas através de diversas fontes, e dentre estas, os micro-organismos são escolhidos devido à sua diversidade bioquímica e susceptibilidade para a manipulação genética. Devido ao potencial dessas enzimas, existe uma procura de novas fontes microbianas, as quais seja possível obter a protease com rapidez e baixo custo no processo de purificação. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar protease com atividade colagenolítica obtida através da Actinobactéria Actinomadura sp., isolada do solo Licania rígida BETH. O microorganismo foi cultivado em meio a base de farinha de soja, líquido metabólico foi concentrado através do processo de precipitação com acetona (70%), seguida foi purificado parcialmente pelo processo de cromatografia de troca iônica em resina de DEAE-sephadex (G-50). A protease com atividade colagenolítica foi eluida, utilizando gradiente de concentração, com solução de NaCl 0,1M em tampão Tris-HCl, pH 8,0. O cromatograma foi obtido através da leitura no comprimento de onda de 280nm. A tabela de purificação foi obtida através da realização da atividade proteásica, da colagenolítica e da concentração proteica em cada etapa de purificação. Para a determinação do peso molecular e da pureza foi realizado a eletroforese em gel (SDS-page). A caracterização da amostra purificada foi realizada através de ensaios de: termoestabilidade, a enzima foi submetida às termperaturas de 50° - 80°C durante 30 minutos; temperatura ótima, nas temperaturas de 30°C – 80°C; pH ótimo, variando o pH5-6 (0,1M do tampão de ácido acético- acetato de sódio ) e 7-9 ( 0,1M do tampão Tris- HCl); efeito de inibidores, utilizando os inibidores fluoreto de fenilmetanosufonil, dodecil sulfato de sódio, beta- mercaptoetanol e pepstatina em contato com a enzima durante 60 minutos; o efeito de íons metálicos, foi utilizado soluções com ions divalentes ( Fe 2+, Mg 2+, Ca 2+, Zn2+) em contato com a enzima durante 60 minutos; e efeito de frequência ultrassônica, enzima submetida a frequência ultrassônica (40 kHz), em diferentes intervalos de tempo. Os resultados obtidos demonstraram que a protease é possível purificar utilizando o gradiente de de NaCl 0,1M em tampão Tris-HCl, pH 8,0, assim como uma atividade colagenolítica específica de 31.094,89 U/mg de proteína, com um fator de purificação de 9,81. Na eletroforese foi possível observar duas bandas, com pesos moleculares de 20 KDa e 45,0 KDa. A enzima apresentou termoestabilidade até 60°C, a temperatura ótima de atividade em 50°C. Sob condições de variação de pH, a atividade enzimática apresentou maiores atividade colagenolítica em faixa de pH 7 a 8, reduzindo bruscamente em pH 9,0. Quando submetida ao efeito da frequência ultrassônica, a enzima após 10 minutos apresentou aumento de 50% de sua atividade colagenolítica inicial. Sendo assim, essa nova biomolécula apresenta potencial biotecnológico, uma vez que o processo de produção envolve um substrato, a farinha de soja, que é amplamente encontrado no Brasil, e o protocolo de purificação desenvolvido foi eficaz para a obtenção da protease com atividade colagenolítica. / Proteases are proteolytic enzymes, which have high interest by industries in various fields. Protease having the helix collagen degradation capacity has been studied for application of the collagen peptides in the treatment of diseases such as hypertension, inhibiting the angiotensin II converting enzyme (ACE), the enzyme itself as well as by pharmaceutical industries in treatment of wounds with necrosis or treatment of Dupuytren's disease. Proteases with collagenolytic activity capable of degrading the collagen can be obtained from several sources, and among them, the micro-organisms are chosen because of their biochemical diversity and susceptibility to genetic manipulation. Because of the potential of these enzymes, there is a demand for new microbial sources, which can be obtained with the protease speed and low cost in the purification process. This study aimed to purify and characterize protease with collagenolytic activity obtained by actinobacteria Actinomadura sp., Isolated from soil of Licania rigida BETH. The microorganism was grown in medium based on soybean flour, metabolic liquid was concentrated by precipitation process with acetone (70%), then was partially purified by ion exchange chromatography procedure resin DEAE-Sephadex (G-50). The protease collagenolytic activity was eluted with using a concentration gradient with 0.1M NaCl solution in Tris-HCl buffer, pH 8.0. The chromatogram was obtained by scanning the wavelength of 280nm. The purification table is obtained by performing the protease activity of collagenolytic and the protein concentration in each purification step. To determine the molecular weight and the purity was conducted gel electrophoresis (SDS-PAGE). Characterization of the purified sample was conducted through tests: thermal stability, the enzyme was subjected to termperaturas 50 ° - 80 ° C for 30 minutes; optimum temperature at temperatures of 30 ° C - 80 ° C; optimum pH, varying the pH5-6 (0.1 M sodium acetate acetic acid-buffer) and 7-9 (0.1 M of buffer Tris- HCl); effect of inhibitors using the inhibitors fenilmetanosufonil fluoride, sodium dodecyl sulfate, beta-mercaptoethanol and pepstatin contact with the enzyme for 60 minutes; The effect of metal ions, was used solutions with divalent ions (Fe 2+, Mg 2+, Ca 2+, Zn 2+) in contact with the enzyme for 60 minutes; ultrasonic frequency and effect, subject enzyme ultrasonic frequency (40 kHz) at different time intervals. The results obtained demonstrated that the protease can be purified using gradient of 0.1 M NaCl in Tris-HCl buffer, pH 8.0, as a specific collagenolytic activity 31094.89 U / mg protein with a factor of purification 9.81. The electrophoresis was observed two bands with molecular weights of 20 KDa and 45 KDa. The enzyme showed thermostability at 60 ° C, the optimum temperature for activity at 50 ° C. Under conditions of varying pH, the enzyme activity showed higher collagenolytic activity in the pH range 7 to 8, reducing sharply at pH 9.0. When submitted to the effect of ultrasonic frequency, the enzyme after 10 minutes increased by 50% from its initial collagenolytic activity. Therefore, this presents new biotechnological potential biomolecule, since the production process involves a substrate, soybean flour, which is widely found in Brazil, and purification protocol was developed to obtain effective protease with collagenolytic activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/17038 |
| Date | 23 February 2015 |
| Creators | SILVEIRA, Luciana Lopes |
| Contributors | PORTO, Ana Lúcia Figueiredo |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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