Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-12T16:05:41Z
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Previous issue date: 2016-03-07 / FACEPE / Os tripanossomatídeos são parasitas flagelados causadores de diversas
doenças humanas e que apresentam algumas características moleculares bem
distintas. Nestes organismos, o controle da sua expressão gênica é quase
exclusivamente pós-transcricional e dados obtidos até o momento sugerem que a
etapa de iniciação da tradução tem um papel importante neste controle. Durante a
iniciação da tradução de eucariotos, o complexo trimérico eIF4F (formado pelas
subunidades eIF4A, eIF4G e eIF4E) tem uma participação importante no
reconhecimento do mRNA, facilitando o recrutamento ribossomal para iniciar a
síntese proteica. Múltiplos homólogos das subunidades do complexo eIF4F foram
identificados em tripanossomatídeos, mas não foi possível elucidar a função
específica de cada um deles. Desta forma, este trabalho teve como objetivo o
desenvolvimento de um ensaio in vivo para a avaliação do efeito da
superexpressão desses homólogos de Trypanosoma brucei na tradução de um
mRNA repórter, o qual codifica a proteína GFP (green fluorescent protein). Três
linhagens repórter foram obtidas (4212, 4213 e 4235) e sete homólogos das
subunidades do complexo eIF4F e um de PABP foram testados nestas linhagens.
A análise da superexpressão foi feita através de ensaios de Western blot, seus
perfis de crescimento foram avaliados por curvas de crescimento e a expressão
de GFP foi avaliada através de citometria de fluxo. Os resultados apresentados
mostram que as linhagens repórter 4213 e 4235 são viáveis para serem utilizadas
na caracterização das proteínas envolvidas no controle da expressão gênica de
tripanossomatídeos. Foi observado que as proteínas EIF4E1 e EIF4E2 provocam
diminuição do crescimento, enquanto a superexpressão de EIF4E3, EIF4E4,
EIF4E4W279A, EIF4G3, EIF4G4 e PABP1 não alteram o crescimento celular dos
parasitas. Apesar da detecção de variações na expressão de GFP durante a
superexpressão de alguns dos homólogos testados, não foi possível, contudo,
confirmar que estas proteínas aumentam ou diminuem a tradução. Ensaios
complementares ainda precisam ser feitos para confirmar a real função destes. / The trypanosomatids are flagellated parasites responsible for several human
diseases and which display unique molecular characteristics. Control of gene
expression in these organisms is almost exclusively post-transcriptional and the
data generated so far suggest that the initiation stage of translation plays an
important role in this control. During translation initiation in eukaryotes, the trimeric
complex eIF4F (formed by the eIF4A eIF4G and eIF4E subunits) has a relevant
role in mRNA recognition and facilitates ribosomal recruitment to start the protein
synthesis. Multiples homologues for the eIF4F subunits have been identified in
trypanosomes, but it has not been possible to elucidate their specific functions.
Thus, this study aimed to develop an in vivo assay to evaluate the effect of the
overexpression of these Trypanosoma brucei homologues during the translation of
a reporter mRNA encoding for the green fluorescent protein (GFP). Three reporter
strains were generated (4212, 4213 and 4235) in which seven homologues of
eIF4F subunits and one of their PABP partner were overexpressed. Confirmation
of overexpression was carried out by Western blot assays, growth profiles were
evaluated by cell counting and GFP expression was assessed by flow cytometry.
The results generated show that the reporter lines 4213 and 4235 are feasible for
use in the characterization of proteins involved in the control of trypanosomatids
gene expression. Overexpression of EIF4E1 and EIF4E2 was seen to induce a
reduction in cell growth, while EIF4E3, EIF4E4, EIF4E4W279A, EIF4G3, EIF4G4 and
PABP1 did not interfere with growh. Despite the detection of variations in GFP
expression during overexpression of some of the homologues tested it was not
possible to confirm if these proteins increase or decrease translation.
Complementary assays still need to be done to confirm the true function of these
factors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/19542 |
| Date | 07 March 2016 |
| Creators | SILVA, Adalúcia da |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/6769466465877287, MELO NETO, Osvaldo Pompílio de, MOURA, Danielle Maria Nascimento |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Genetica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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