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Previous issue date: 2013-06-28 / FACEPE, CNPQ / A iniciação da tradução em eucariotos é um ponto crucial no processo de síntese protéica e de sua regulação. Nesta etapa atua o complexo heterotrimérico eIF4F (formado pelas subunidades eIF4E, eIF4G e eIF4A), que atua recrutando a subunidade ribossomal 40S para o mRNA, para iniciar a tradução. O reconhecimento dos mRNAs se dá pela ligação da subunidade eIF4E no cap presente na sua extremidade 5’, junto com a ligação da proteína de ligação ao poli-A (PABP), que interage diretamente com o eIF4G, na extremidade 3’ destes mesmos mRNAs. Vários homólogos destes fatores foram encontrados nos tripanosomatídeos, indicando uma complexidade na iniciação da tradução que pode estar associada aos ciclos de vida únicos destes parasitas. Destes, dois complexos eIF4F típicos foram caracterizados, baseados em dois homólogos de eIF4E denominados de EIF4E3 e EIF4E4. Neste trabalho, a análise da expressão destas duas proteínas em Leishmania amazonensis mostrou que ambas são alvos de modificações pós-traducionais, identificadas como fosforilação, gerando múltiplas isoformas. O padrão de expressão dos dois conjuntos de isoformas é alterado com a inibição do processamento de mRNAs e a inibição da tradução interfere especificamente com as isoformas do EIF4E3. Curvas de sincronização celular sugerem uma associação de isoformas específicas com o ciclo celular do parasita. Múltiplos eventos de fosforilação parecem agir, porém de forma diferenciada, sobre os dois homólogos eIF4E. Diferentemente do EIF4E4, o EIF4E3 possui diferenças de expressão entre espécies de Leishmania, com uma banda de maior peso molecular, típica de células estressadas, encontrada apenas em L. amazonensis. A análise da seqüência do gene EIF4E3 de três espécies de Leishmania mostrou que poucas mudanças de aminoácidos levam a diferenças marcantes de migração das respectivas proteínas em gel desnaturante. Ensaios de mutagênese, associados a expressão ectópica do EIF4E3 contendo um epítopo HA em células de Leishmania transfectadas, identificou a serina 75, exclusiva de L. amazonensis, como sítio responsável pela geração da isoforma específica desta espécie. Análises em gel bidimensional mostraram que esta isoforma não está associada a alterações no ponto isoelétrico, indicando que outro tipo de modificação, além das fosforilação, deve ter como alvo o EIF4E3. Experimentos de interação in vitro e in vivo demonstraram que os EIF4E3 e 4 interagem diferencialmente com homólogos de PABP e realizam outras interações conservadas em espécies de tripanosomatídeos. Os resultados obtidos neste trabalho indicam uma complexa regulação destes fatores, através de múltiplos sítios de fosforilação, provavelmente relacionada com o ciclo celular do parasita. / Translation initiation in eukaryotes is a critical stage within the process of protein synthesis and its regulation. A major player is the heterotrimeric eIF4F complex (formed by the eIF4E, eIF4G and eIF4A subunits) which acts by recruiting the 40S ribosomal subunit to the mRNA to initiate translation. mRNA recognition occurs through the binding of the eIF4E subunit to its 5 'end cap as well as the binding of the poly-A binding protein (PABP), which interacts directly with eIF4G, to its 3' end poly-A tail. Various homologues for the eIF4F subunits were found in trypanosomatids, indicating a greater complexity within translation initiation which can be associated with the parasites unique life cycle. Two typical eIF4F complexes were characterized based on two eIF4E homologues, named EIF4E3 and EIF4E4. In this study, expression analysis of both proteins in Leishmania amazonensis showed that both are targets for post-translational modifications, identified as phosphorylation, leading to multiple isoforms. The expression pattern of the two sets of isoforms is altered with inhibition of mRNA processing but translation inhibition specifically interferes with the EIF4E3 isoforms. Cell synchronization curves suggest an association of specific isoforms with the parasite cell cycle. Multiple phosphorylation events appear to differentially target the two eIF4E homologues. Unlike EIF4E4, expression of EIF4E3 differs between Leishmania species, with a higher molecular weight band, typical of stressed cells, found only in L. amazonensis. Sequence analysis of the EIF4E3 gene from three Leishmania species showed that few amino acid changes lead to marked differences in migration of the respective proteins in denaturing gel. Mutagenesis assays associated with ectopic expression of an HA-tagged EIF4E3 in transfected Leishmania identified serine 75, exclusive of L. amazonensis, as a site responsible for generating the isoform specific to this species. Two-dimensional gel analysis showed that this isoform is not associated with changes in isoelectric point, indicating that other modifications, in addition to phosphorylation, must target EIF4E3. In vitro and in vivo interaction studies demonstrated that EIF4E3 and 4 differentially bind to PABP homologues as well as performing other interactions conserved in various trypanosomatid species. The results produced in this study indicate a complex regulation of these factors through multiple phosphorylation sites, probably related to the cell cycle of the parasite.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/23897 |
| Date | 28 June 2013 |
| Creators | PEREIRA, Mariana Marques Coutelo |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/6769466465877287, MELO NETO, Osvaldo Pompilio de |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Genetica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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