Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-03T21:24:02Z
No. of bitstreams: 2
license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5)
TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-17T22:19:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2
license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5)
TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T22:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2
license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5)
TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5)
Previous issue date: 2011-12-20 / CAPES / Materiais queratinosos são insolúveis e resistentes à degradação por enzimas proteolíticas comuns, tornando-se importante o estudo de microrganismos produtores de queratinases para ser usado na indústria biotecnológica. O objetivo deste estudo foi selecionar fungos isolados do solo armazenados na Micoteca URM, para ser empregado na síntese de queratinases extracelular, caracterizar as cepas quanto a capacidade queratinolítica, efeito de diferentes substratos, da composição do meio e das condições de cultivo na produção de queratinase em cultivo submerso, otimizara aprodução, caracterizar e purificar a enzima. Para a determinação da capacidade de utilizar substratos queratinosos, 50 cepas fúngicas foram utilizadas. Elas foram cultivadas em fermentação submersa em meio contendo sais e penas durante 10 dias a 30 °C em agitador orbital a 120 rpm. Para avaliar a capacidade queratinolítica e o efeito de diferentes substratos na produção da queratinase foram utilizadas as seguintes cepas: Aspergillus sulphureus URM 5029, A. avenaceus URM5051, A. sclerotiorum URM5586 e Trichoderma aureoviride URM5574. Com a linhagem que apresentou a melhor produção e o melhor substrato, foi realizado estudos do efeito da composição do meio, condições de cultivo na produção da queratinase, otimização da produção, caracterização e purificação da enzima. Aspergillus sulphureus, Trichoderma aureoviride, Aspergillus avenaceus e A. sclerotiorum mostraram os melhores resultados com 7,35 U /ml, 7,2 U/ml, 6,7 U/ml e 6,05 U/ml de atividade queratinolítica, respectivamente. As espécies testadas se destacaram na colonização dos diferentes substratos queratinosos e o melhor substrato para a produção de queratinase foi a pena de frango. A produção de queratinase por A. sulphureus foi incrementada nas seguintes condições: 2 g/50 ml de pena de frango, 0,1 g/50 ml de NaNo₃, 0,001 g/50 ml de CaCl₂, pH 7,8, 35ºC, 160 rpm e 10⁶ esporos/ml em cultivo líquido submerso em 10 dias de incubação. A partir desses resultados foi realizado um planejamento fatorial completo 2⁴, para otimizar a produção da queartinase, e as melhores condições de produção foram: pH 8,0, 36 °C, 120 rpm, 2,5% (p/v) de penas de frango em 10 dias, com a máxima atividade de 10,06 U/ml, mostrando um aumento de 1,44 vezes. A queratinase de A. sulphureus apresentou melhor atividade em pH 10,0 e 35 ºC e é pouco inibida na presença de íons metais (Co²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺) e PMSF e fortemente inibida por EDTA, sugerindo ser uma metaloprotease. As melhores condições para purificação da queratinase de Aspergillus sulphureus, após análise estatística, foram: massa molecular do PEG, 8000; concentração do PEG, 20% e concentração de citrato 15%, apresentando aumento de pureza e recuperação queratinolítica de 25,04 e 184,9%, respectivamente. Com base nos resultados, concluímos que a preservação, sob óleo mineral é satisfatório para manter a viabilidade e a taxonomia das culturas por longos períodos de tempo e os microorganismos do solo podem ser uma interessante fonte de fungos produtores de queratinases. Além disso a capacidade da queratinase de A. sulphureus ser estável em uma ampla faixa de pH (6,5–9,0) e temperatura (25–60 °C) sugere o uso desta cepa em processos biotecnológicos industriais. / Keratinous materials are insoluble and resistant to degradation by common proteolytic enzymes, making it important to study keratinases producing microorganisms for use in the biotechnology industry. The aim of this study was to select fungi isolated from soil stored in the URM Culture Collection, to be employed in the synthesis of extracellular keratinases, characterize the strains and the ability queratinolítica, effect of different substrates, the medium composition and cultivation conditions in the production of keratinase in submerged culture, aprodução optimize, characterize and purify the enzyme. To determine the ability to use keratinous substrates, 50 fungal strains were used. They were grown in submerged fermentation in medium containing salts and penalties for 10 days at 30 ° C on an orbital shaker at 120 rpm. To assess the ability queratinolítica and the effect of different substrates on keratinase production we used the following strains: Aspergillus sulphureus URM 5029, A. avenaceus URM5051, A. sclerotiorum URM5586 and Trichoderma aureoviride URM5574. With a lineage that had the best production and best substrate, was carried out studies of the effect of medium composition, cultivation conditions on keratinase production, production optimization, characterization and purification of the enzyme. Aspergillus sulphureus, Trichoderma aureoviride, Aspergillus avenaceus and A. sclerotiorum showed the best results with 7.35 U / ml, 7.2 U / ml, 6.7 U / ml and 6.05 U / ml keratinolytic activity, respectively. The species tested stood out in the colonization of different keratinous substrates and the best substrate for the production of keratinase was the poultry feathers. Keratinase production by A. sulphureus was increased in the following conditions: 2 g/50 ml of poultry feathers, 0.1 g/50 ml of NaNO3, CaCl2 0.001 g/50 ml, pH 7.8, 35 ° C, 160 rpm and 106 spore/ml in submerged in liquid culture 10 days of incubation. From these results we carried out a full 2⁴ factorial design to optimize the production of queartinase, and the best production conditions were: pH 8.0, 36 ° C, 120 rpm, 2.5% (w/v) feather chicken in 10 days, with maximum activity of 10.06 U/ml, showing an increase of 1.44 times. The keratinase of A. sulphureus showed better activity at pH 10.0 and 35 ° C and is slightly inhibited in the presence of metal ions (Co²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺) and PMSF and strongly inhibited by EDTA, suggesting that a metalloprotease. The best conditions for purification of keratinase from Aspergillus sulphureus, after statistical analysis were: molecular weight of PEG 8000, PEG concentration, 20% and 15% concentration of citrate, an increase of purity and keratinolytic recovery of 25.04 and 184.9%, respectively. Based on the results, we conclude that the preservation under mineral oil is satisfactory to maintain the viability and taxonomy of cultures for long periods of time and soil microorganisms may be an interesting source of keratinases producing fungi. Furthermore the ability of keratinase of A. sulphureus be stable over a wide pH range (6.5 to 9.0) and temperature (25-60 ° C) suggests the use of this strain in industrial biotechnology processes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/26636 |
| Date | 20 December 2011 |
| Creators | SOUSA, Minelli Albuquerque |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/0573658625006450, MOTTA, Cristina Maria de Souza, PORTO, Ana Lúcia Figueiredo, PESSOA JÚNIOR, Adalberto |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Biologia de Fungos, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0148 seconds