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Previous issue date: 2016-11-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A busca por novos fármacos têm levado as pesquisas ao encontro dos produtos
naturais que oferecem uma quantidade inimaginável de princípios ativos ainda
desconhecidos. A apicultura moderna é um segmento da agropecuária que fornece
alguns produtos naturais como a própolis, o mel, a cera, a geleia real e a apitoxina,
que vêm sendo alvo de pesquisas devido às diversas atividades biológicas já
apresentadas. A apitoxina (veneno de abelhas) é uma complexa mistura de
substâncias bioativas, entre elas os peptídeos apamina e melitina. O primeiro tratase
da menor neurotoxina conhecida e com apenas 18 aminoácidos em sua
composição representa 2% do peso seco do veneno. Já melitina, composta de 26
aminoácidos, corresponde a 50% do peso seco do veneno e é um conhecido
peptídeo tóxico capaz de causar lise em diversos tipos celulares. Neste sentido, este
estudo objetivou caracterizar estes dois peptídeos quanto à sua citotoxicidade e seu
poder antimicrobiano. Através do ensaio de redução do MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-
2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo) foi possível determinar as concentrações
citotóxicas de melitina para 50% dos cultivos celulares (CC50), que variou de 2,3 a
4,1 μg/mL e a CC90, que variou de 2,7 a 4,7 μg/mL para diferentes linhagens
celulares e, ao expor estas células frente à melitina por diferentes períodos pôde-se
observar que com apenas 5 minutos de exposição, houve queda nas viabilidades
celulares. Já os ensaios de toxicidade realizados em citometria de fluxo demonstram
que, com concentrações de melitina abaixo das consideradas tóxicas pelo ensaio de
redução do MTT, as células já apresentavam sinais de toxicidade da melitina,
alterando os padrões de apoptose e necrose, aumentando a peroxidação das
membranas lipídicas (LPO), assim como a produção intracelular de espécies
reativas ao oxigênio (ROS) e da fragmentação de seu DNA. Por microscopia
confocal foi possível a observação de focos de apoptose e necrose e do aumento da
fluidez das membranas das células proporcional ao aumento da concentração de
melitina em que essas foram expostas. Houve correlação positiva entre LPO e ROS
(r=0,3158, p<0,05), taxa de apoptose (r= 0,4978, p<0,05) e com a funcionalidade
das mitocôndrias (r= 0,3149, p<0,05). LPO parece iniciar os demais eventos de
toxicidade celular avaliados e aumentar a funcionalidade mitocondrial em resposta
ao estresse sofrido pelas células. Sendo assim, a citometria de fluxo e a microscopia
confocal demonstraram eficiência em auxiliar a desvendar os mecanismos de
toxicidade de melitina e se portam como técnicas complementares ao ensaio MTT,
que avalia a viabilidade celular apenas através da funcionalidade mitocondrial.
Quanto à atividade antiviral da melitina, houve a inativação de herpesvírus bovino
tipo 1 (BoHV-1), especialmente na concentração 2μg/ml. Apamina atuando isoladamente não apresentou poder antiviral, porém quando aliada à melitina,
apresentou efeito antiviral contra o vírus da diarreia viaral bovina (BVDV).
Resultados com padrões semelhantes ocorreram ao analisar o poder virucida das
substâncias, quando melitina inativou BoHV-1 em 2 horas de incubação com este
vírus mas não apresentou ação contra o BVDV, assim como a apamina, mas a
associação potencializou o efeito virucida contra BVDV. Já quanto à atividade
antibacteriana, a concentração inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima (CBM)
de melitina foram, respectivamente (em μg/ml), frente a Staphylococcus aureus (6-7
e 32-64), Escherichia coli (40-42,5 e 64-128) e Pseudomonas aeruginosa (65-70 e
64-128). Biofilmes de S. aureus foram mais sensíveis à ação da melitina quanto
comparados aos biofilmes produzidos pelas Gram negativas. Melitina foi capaz de
destruir biofilmes pré-formados pelas três espécies bacterianas estudadas além de
inibir a formação dos biofilmes por estas espécies quando foram previamente
incubadas com melitina em concentrações abaixo da CIM. Os resultados são
promissores quanto à capacidade antimicrobiana das substâncias apresentando
potencial para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou sanitizantes e, os
mecanismos de toxicidade avaliados podem auxiliar nesse desenvolvimento. / The search for new drugs leads the researchs to meeting the natural products that
offers an unimaginable amount of still unknown active principles. The modern
apiculture is a segment of agriculture that provides some natural products such as
propolis, honey, wax, royal jelly and apitoxin, which have been the subject of
research due to the various biological activities already presented. Apitoxin (bee
venom) is a complex mixture of bioactive substances, and between them the
peptides apamin and melittin. The first is the smaller known neurotoxin and, with
only 18 amino acids in its composition, represent 2% of the dry weight of the venom.
Melitin, composed of 26 amino acids, corresponds to 50% of the dry weight of the
venom and is a known toxic peptide capable of causing lysis in several cell types. In
this sense, this study aims to characterize these two peptides as to their cytotoxicity
and their antimicrobial power. By the reduction of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -
2-5-diphenyl-2H-tetrazolate bromide) test, it was possible to determine the cytotoxic
concentrations of melittin to 50% of the cell cultures (CC50) which ranged from 2.3 to
4.1 μg / mL and CC90, ranging from 2.7 to 4.7 μg / mL for different cell lines, and by
expose these cells to melina for different periods it was observed that only 5 minutes
of exposure, there was decrease in cellular viability. The toxicity tests performed in
flow cytometry shows that, with melittin concentrations below the toxic concentration
considerated by the MTT reduction test, the cells showed signs of melittin toxicity,
altering the patterns of apoptosis and necrosis, increasing the peroxidation of
membranes (LPO), as well as an intracellular production of oxygen reactive species
(ROS) and the fragmentation of their DNA. By confocal microscopy it was possible to
observe foci of apoptosis, necrosis and the increase of cell membranes fluidity
proportional to the increase in the concentration of melittin in which they were
exposed. There was a positive correlation between LPO and ROS (r = 0.3158, p
<0.05), apoptosis rate (r = 0.4978, p <0.05) and mitochondrial functionality (r =
0.3149, P0.05). LPO seems to initiate the other evaluated events of cellular toxicity
and increase mitochondrial functionality in response to the stress undergone by the
cells. Therefore, the flow cytometry and confocal microscopy have demonstrated
efficiency in helping to unravel the mechanisms of melittin toxicity and behave as
complementary techniques to the MTT assay, which evaluates the cellular viability by
mitochondrial functionality. As for the antiviral activity of melittin, there was
inactivation of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), especially at 2μg / ml
concentration. Apamin acting alone did not present antiviral power, but when allied to
melittin, presented antiviral effect against bovine viral diarrhea virus (BVDV). Results
with similar patterns ocurred when analyzing the virucidal power of the substances, when melittin inactivated BoHV-1 with 2 hours of incubation with this virus but
showed no action against BVDV, as well as apamine, but the association potentiated
their virucidal effect against BVDV. As for antibacterial activity, the minimum
inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) of
melittin were, respectively (in μg / mL), against Staphylococcus aureus (6-7 and 32-
64), Escherichia coli (40- 42,5 and 64-128) and Pseudomonas aeruginosa (65-70
and 64-128). Biofilms of S. aureus were more sensitive to the action of melitin
compared to biofilms produced by Gram negative bacteria. Melittin was able to
destroy preformed biofilms by the three bacterial species studied and inhibited the
formation of biofilms by these species when they were previously incubated with
melittin at concentrations below MIC. The results are promising as to the
antimicrobial capacity of the substances presenting potential for the development of
new drugs and / or sanitizers and the mechanisms of toxicity can aid in the
development.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:prefix/3950 |
| Date | 28 November 2016 |
| Creators | Picoli, Tony |
| Contributors | 64078833004, http://lattes.cnpq.br/6163020760854309, Fischer, Geferson |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Veterinária, UFPel, Brasil, Faculdade de Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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