Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T20:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1
313176.pdf: 31537040 bytes, checksum: 2b55698432e1ff3ffc517949aac3d02b (MD5) / Dentre os vários fatores de crescimento que têm sido relatados na literatura para tratamento de defeitos ósseos, as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) têm atraído bastante interesse, em decorrência de sua capacidade osteoindutora. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) também vêm se destacando na regeneração tecidual e na modulação da resposta inflamatória pelo seu efeito parácrino. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro e in vivo os efeitos da BMP-2 e de ASCs na osteogênese. Os experimentos se dividiram em 4 etapas, sendo: (1) avaliação do efeito da proteína óssea morfogenética recombinante humana do tipo 2 (rhBMP-2), da BMP-4 e da BMP-7 na diferenciação osteogênica de ASCs suplementadas com arcorbato e ?-glicerofosfato; (2) comparação do efeito do ácido retinóico (AR), da rhBMP-2 e da rhBMP-2+AR na diferenciação osteogênica de ASCs; (3) avaliação do efeito da implantação de ASCs incorporadas em arcabouços de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) na inflamação causada por rhBMP-2 no tecido muscular de cães; e (4) avaliação do efeito de ASCs incorporadas em arcabouços autógenos de plasma rico em plaquetas (PRP) na regeneração óssea na tíbia de cães. Os resultados confirmaram as caracterísitcas de células-tronco mesenquimais das ASCs, através da imunofenotipagem e da diferenciação adipogência e osteogênica. Em relação à etapa 1, as ASCs expressaram BMP-4 e BMP-7 endógenas, a suplementação do meio osteogênico com rhBMP-2 não aumentou a atividade de ALP, a expressão do mRNA da osteonectina e osteocalcina, e a deposição de cálcio. No que diz respeito à etapa 2, a rhBMP-2 promoveu maior expressão de Smad 1 e BMP-7 (dia 7), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (BMPR-II) e do mRNA da osteocalcina (dia 21). Por sua vez, o AR exibiu as maiores atividades de ALP (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (RBMP-II) (dia 14), do mRNA da Smad 1 (dia 21) e do mRNA da osteonectina (dias 14, 21 e 28). A associação rhBMP-2+AR promoveu os maiores níveis de cálcio na matriz extra-celular (dias 12 e 32), a expressão da Smad 4 considerável (dias 21 e 28), expressão da Smad 1/ 5/ 8 fosforilada similar ao MC3T3-E1 (controle positivo) (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA da Smad 1, mRNA da osteocalcina e mRNA da osteonectina (dias 14, 7 e 7, respectivamente). Em relação à etapa 3, a agregação da rhBMP-2 aos arcabouços foi de aproximadamente 78, 74 e 61% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. A liberação acumulada da rhBMP-2, em 21 dias, foi de aproximadamente 90, 64 e 64% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. Os arcabouços de PLGA foram quase que totalmente degradados em 6 semanas de pós-operatório. As ASCs foram capazes de modular a resposta inflamatória causada por baixa dose de rhBMP-2 (2,5?g) no tecido muscular de cães, diminuindo o número de focos inflamatórios, células gigantes e aumentando a neovascularização. Os resultados da etapa 4 mostraram que PRP+ASCs apresentou menor quantidade de tecido de granulação e promoveu maior quantidade (osso primário e secundário) e maturação (osso secundário) de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP, isoladamente. Resumidamente, pode-se concluir que a suplementação da rhBMP-2 ao meio osteogênico não melhorou a osteogênese das ASCs; a associação de rhBMP-2+AR se mostrou mais eficiente na osteodiferenciação das ASCs, comparado com rhBMP-2 ou AR isoladamente; as ASCs reduziram o processo inflamatório e aumentaram a neovascularização nos sítios musculares que receberam baixa dose de rhBMP-2; e as ASCs associadas com PRP apresentaram menor quantidade de tecido de granulação e promoveram maior quantidade e maturação de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP.<br) / Abstract : Recombinant human bone morphogenetic protein type 2 (rhBMP-2) is a potent osteogenic growth factor, which has been used for
treatment of bone defects in maxillofacial, oral, orthopedic, and
spine surgeries. The adipose-derived stem cells (ASCs) have
been draun attention in tissue regeneration and modulation of
inflamatory disease because of their paracrine effect. This study
evaluated the in vitro and in vivo effects of rhBMP-2 and ASCs in
osteogenesis. The experiments were divided into 4 parts: (1)
evaluated the effect of recombinant human bone morphogenetic
protein type 2 (rhBMP-2), BMP-4, and BMP-7 in osteogenic
differentiation of ASCs suplemented with arcorbate and â-
glycerophosphate; (2) compared the effect of retinoic acid (RA),
rhBMP-2, and rhBMP-2+AR in osteogenic differentiation of ASCs;
(3) evaluated the effect of the implantation of ASCs incorporated
into scaffolds of poly lactic-co-glycolic (PLGA) in canine muscular
tissue; and (4) evaluated the effect of ASCs incorporated into
scaffolds of platelet-rich plasm (PRP) in bone regeneration in
canine tibia. The results confirmed the mesenchymal stem cells
characteristics of ASCs. According to part 1, ASCs expressed
endogenous BMP-4 and BMP-7. The supplementation of
osteogenic medium with rhBMP-2 did not increase ALP activity,
mRNA expression of osteonectin and osteocalcin, and the
calcium deposition. According to the results of part 2, rhBMP-2
promoted the highest expression of Smad1 and BMP-7 (day 7),
the highest relative expression of BMP receptor type II (BMPR-II)
mRNA and osteocalcin mRNA (day 21). RA exhibited the highest
phosphatase alkaline activity (ALP) (days 7, 14, 21 and 28),
highest expression of BMPR-II mRNA (day 14), Smad 1 mRNA
(day 21) and osteonectin mRNA (days 14, 21, and 28). The
association rhBMP-2+RA promoted the highest levels of calcium
in extracellular matrix (days 12 and 32), a considerable
expression of Smad 4 (days 21 and 28), expression of
phosphorylated Smad 1/ 5/ 8 similar to MC3T3-E1 (positive
control) (days 7, 14, 21, and 28), the highest expression of Smad
1 mRNA, osteocalcin mRNA, and osteonectin mRNA (days 14, 7,
and 7, respectivamente). According to part 3, the rhBMP-2
loading into the scaffolds was approximately 78, 74, and 61% for
1, 2.5, and 5 ìg of rhBMP-2.mL-1, respectively. Cumulative rhBMP-2 release was approximately 90, 64, and 64% for 1, 2.5,
and 5 ìg of rhBMP-2.mL-1, respectively, at day 21. PLGA
scaffolds were almost completely degradated at 6 weeks
postoperative. ASCs modulated inflammatory response induced
by low dose of rhBMP-2 (2.5ìg) in muscle sites, decreasing the
number of inflammatory foci, giant cells, and neovascularization.
The results of part 4 showed that PRP+ASCs promoted the
fewest formation of granulation tissue, the highest amount of
bone neoformation (primary and secondary bone), and the
highest level of bone maturation in bone deffects, compared to
autogenous bone and PRP, alone. In summary, supplementation
of osteogenic medium with rhBMP-2 did not improve the
osteogenic differentiation of ASCs; the assotiation rhBMP-2+RA
was more efficient on osteodifferentiation process compared to
rhBMP-2 or RA alone; ASCs modulated the inflammatory process
and increased neovascularization in muscle sites with low dose of
rhBMP-2; the assotiation ASCs+PRP promoted the lowest
number of granulation tissue and increased the amount of bone
neoformation (primary and secondary bone) and maturation in
bone deffects, compared to autogenous bone and PRP, alone.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/100605 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Cruz, Ariadne Cristiane Cabral da |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Simões, Cláudia Maria Oliveira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 155 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0024 seconds