Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:02:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Leishmania (Viannia) braziliensis, Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi são parasitos hemoflagelados pertencentes à Ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, capazes de infectar insetos, animais silvestres e domésticos, assim como o homem. Durante seu ciclo de vida, estes parasitos são expostos a uma grande quantidade de espécies reativas do oxigênio (ERO) e do nitrogênio (ERN), o que promove sua eliminação dentro dos hospedeiros. Por sua vez, os parasitos adotam diferentes mecanismos de defesa para lidar com essas condições de estresse, dentre dos quais, encontram-se um elaborado sistema antioxidante composto de moléculas e enzimas responsáveis pela eliminação das ERO e/ou das ERN. Nesse sentido, em tripanosomátidos a tripanotiona T[SH]2 é a molécula que eficientemente regula a homeostase redox, sendo chave no mecanismo de defesa antioxidante. A síntese da T[SH]2 depende da disponibilidade de seus precursores como a cisteína, um aminoácido sulfurado implicado em diversos processos celulares como a estabilidade, a estrutura e a regulação da atividade catalítica de várias proteínas. Duas vias diferentes para a biossíntese de cisteína têm sido descritas, a via de síntese de novo, catalisada principalmente pela Cisteína Sintase (CS), e a via de transulfuração reversa (RTS), catalisada pela Cistationina ß-Sintase (CßS). Uma vez que o metabolismo da cisteína é crucial para a biossíntese da tripanotiona, a presente proposta visou determinar a função que as proteinas CS e CßS desempenham na resposta antioxidante destes parasitos. Assim sendo, realizamos a caracterização molecular e bioquímica dos genes da CS e CßS em parasitos sob condições de estresse oxidativo e nitrosativo in vitro. Os resultados demonstram claras diferenças na biossíntese de cisteína entre estes parasitos. Enquanto L. braziliensis e T. cruzi possuem as rotas de novo e RTS ativas, o T. rangeli possui somente a via RTS funcional. A avaliação da expressão das proteínas CS e CßS nas diferentes formas evolutivas destes parasitos revelou uma expressão estágio-dependente das duas proteínas em L. braziliensis e em T. cruzi, sendo a CS mais expressa nas formas amastigotas e a CßS nas formas promastigotas e epimastigotas, respectivamente. Por sua vez, em T. rangeli a CS não foi detectada e nenhum tipo de modulação foi encontrado para CßS entre as formas epimastigota e tripomastigota. Os ensaios de dose-resposta ao estresse por H2O2 e SNAP in vitro revelaram diferenças nos perfis de sensibilidade dos parasitos. O T. rangeli mostrou-se como o parasito mais sensível ao H2O2, porém o mais resistente ao SNAP, enquanto L. braziliensis apresentou a maior resistência ao H2O2 e a maior sensibilidade ao SNAP. Para Leishmania houve uma associação entre o aumento da expressão e da atividade da CS e da CßS com o aumento da concentração de tióis totais em resposta à indução de estresse oxidativo e nitrosativo in vitro. Os resultados das análises funcionais mostraram que o aumento na expressão de CS e de CßS induz resistência dos parasitos mutantes ao estresse oxidativo em relação às cepas selvagens. Neste estudo demonstrou-se que alterações nos níveis de expressão e de atividade das proteínas CS e CßS em L. braziliensis e T. rangeli estão relacionadas com a sobrevivência destes parasitos sob condições de estresse oxidativo.<br> / Abstract: Leishmania (Viannia) braziliensis, Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi, are hemoflagellates parasites belonging to the order Kinetoplastida, family Trypanosomatidae, can infect insects, and animals as well as humans. During their complex life cycle, they are exposed to a large amount of reactive oxygen species or reactive nitrogen species (ROS and RNS) generated by the host allowing their elimination. In turn, parasites adopt various defense mechanisms to cope with oxidative or nitrosative stress, they have developed an elaborate antioxidant system composed of molecules and enzymes to scavenge these ROS and RNS. In this sense, trypanothione T[SH]2 is which efficiently regulate the redox homeostasis on these parasites. The synthesis of trypanothione depends on the availability of cysteine, a sulfur-containing amino acid implicated in several processes, including the stability, structure, regulation of catalytic activity of various proteins. Two different routes for cysteine biosynthesis have been described: de novo or assimilatory where CS is regulated key enzyme and reverse-transsulfuration (RTS) pathways with a CßS as regulated key enzyme. Because the cysteine metabolism is considered crucial in maintaining the reducing environment for trypanosomatids due to its importance as a precursor for the biosynthesis of trypanothione, this proposal aimed to determine the role of the CS and CßS in the antioxidant response of these parasites by molecular and biochemical characterization of the genes encoding these proteins in the parasite under oxidative and nitrosative stress in vitro. Our results clearly demonstrated differences between these parasites in the cysteine biosynthesis. L. braziliensis and T. cruzi have active the two pathways (de novo and RTS), whereas T. rangeli only has the RTS pathway. The expression and activities analyses of CS and CßS in the different developmental forms of the parasites revealed that in L. braziliensis and T. cruzi there are a stage-specific association, where CS is more active and mostly expressed in amastigotes and CßS is associated with promastigotes and epimastigotes forms, respectively. Unlike in T. rangeli CS was not detected and no stage-specific association was found for CßS. The dose response assay to H2O2 and SNAP shown differences in susceptibility profiles for these parasites. T. rangeli was more susceptible to H2O2, but more resistant to SNAP, while L. braziliensis was more resistant to H2O2, but more sensitive to SNAP. Additionally, in Leishmania there was a clear association between the increased levels of protein expression and activity of LbrCS and LbrCßS with the elevated levels of total thiols concentration in response to oxidative and nitrosative stress in vitro. In the functional analyses, we found an enhanced ability of parasites overexpressing CS and CßS to resist oxidative stress when compared to the control parasites. In this study we clearly demonstrated that changes in the expression protein and activity levels of CS and CßS may be related to survival to oxidative stress conditions in L. braziliensis and T. rangeli.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/132418 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Romero Calderon, Ibeth Cristina |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Grisard, Edmundo Carlos |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 151 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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