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Previous issue date: 2008-03-14 / Universidade Federal de Sao Carlos / The increment of the expression of complex correctly processed recombinant proteins,
like the ones produced by animal cells, is essential for the development of an efficient large
scale bioprocess. The manipulation of culture conditions plays a very important role in the
controlled and optimized expression of these proteins in bioreactors. The response of
mammalian and insect cells to temperature effect has been studied by several researchers as a
potential strategy to enhance production of recombinant proteins. The present study evaluated
the influence of the temperature in the culture of recombinant Drosophila melanogaster S2
cells in Sf-900 II medium supplemented with aminoacids with the aim of enhancing the
production of the rabies virus glycoprotein (RVGP). The cultures were carried out in Schott
flasks (in shaker) as well as in a bubble-free stirred tank bioreactor. Five temperatures were
tested in Schott flasks cultures: 16, 20, 24, 28 and 34ºC. The results obtained in cultures at
those temperatures in terms of maximum specific growth rate (µmax) and maximum RVGP
concentration (CGPV
max) were, respectively: 0.009, 0.020, 0.039, 0.036 and 0.022 h-1, and
0.075, 2.973, 0.480, 1.404 and 0.013 mg.mL-1. The best temperature for RVGP production
(20oC) was chosen to be evaluated in the bioreactor operated in batch and feed-batch mode,
keeping 28oC as control. The results of µmax and CGPV
max in batch mode were: 0,061 h-1 and
0,149 mg.mL-1 at 28oC and 0,027 h-1 and 0.354 mg.mL-1 at 20oC. A batch experiment with
stepwise temperature decrease from 20ºC to 16ºC presented a µmax ranging from 0.024 to
0.012 h-1 and a final CGPV
max of 0.567 mg.mL-1. On the other hand, at 20ºC in feed-batch
mode, µmax was 0.024 h-1 and CGPV
max 1.155 mg.mL-1. The larger production of RVGP
observed in Schott flasks can be a consequence of a more favorable condition for the
expression of the protein at low values of dissolved oxygen concentrations that are seen in
flasks but not in controlled bioreactor cultures at 50% DO. Overall, these results show an
increase of recombinant protein expression at lower temperatures, especially when µmax is
kept fairly low. The largest production of RVGP was obtained in the culture at 20°C in Schott
flask when CGPV
max was 2.973 mg.mL-1, while the production obtained at the control
temperature of 28ºC was only of 1.404 mg.mL-1. Thus, the use of reduced culture
temperatures, around 20°C, seems to be the best strategy for the optimization of RVGP
production. / aumento da expressão de proteínas recombinantes complexas corretamente processadas
como as produzidas por células animais é essencial para o desenvolvimento de um
bioprocesso eficiente em larga escala. A manipulação das condições de cultivo desempenha
um papel muito importante na expressão otimizada e controlada dessas proteínas em
biorreatores. A resposta de células de mamíferos e de insetos quando submetidas ao efeito da
temperatura vem sendo estudada por vários pesquisadores como estratégia potencial para o
aumento de expressão de proteínas recombinantes. No presente trabalho propõe-se avaliar a
influência da temperatura no cultivo celular com o propósito de intensificar a produção da
glicoproteína do vírus da raiva (GPV) em cultivo de células de Drosophila melanogaster S2
recombinante em meio de cultura Sf900-II suplementado com aminoácidos, em frascos Schott
(em shaker) e em biorreator de tanque agitado livre de bolhas. Para tal, foram avaliadas cinco
temperaturas de cultivo em frasco Schott: 16, 20, 24, 28 e 34ºC. Os resultados obtidos de
velocidade específica de crescimento máxima (µmax) nesses cultivos foram, respectivamente:
0,009, 0,020, 0,039, 0,036 e 0,022 h-1, e de concentração máxima de GPV (CGPV
max): 0,075,
2,973, 0,480, 1,404 e 0,013 mg.mL-1. A melhor temperatura para produção de GPV (20oC) foi
escolhida para ser testada em biorreator operado em batelada e batelada alimentada, mantendo
28oC como controle. Os resultados de µmax e CGPV
max em batelada foram: 0,061 h-1 e 0,149
mg.mL-1 a 28oC e 0,027 h-1 e 0,354 mg.mL-1 a 20oC. Um experimento em batelada com
temperatura decrescente em etapas de 20ºC a 16oC apresentou um µmax variando de 0,024 a
0,012 h-1 e uma CGPV
max final de 0,567 mg.mL-1. Por outro lado, a 20ºC em batelada
alimentada, µmax foi de 0,024 h-1 e CGPV
max de 1,155 mg.mL-1. A maior produção de GPV
observada em frascos Schott pode ser conseqüência de uma condição mais favorável para
expressão da proteína em condições de baixa concentração de oxigênio dissolvido como as
usuais em frascos Schott mas não em cultivos em biorreator com oxigênio dissolvido
controlado a 50%. Em geral, estes resultados mostram uma maior expressão da proteína
recombinante nas temperaturas mais baixas, especialmente quando µmax é mantido
razoavelmente baixa. A maior produção de GPV foi obtida no cultivo realizado a 20ºC em
frasco Schott quando CGPV
max=2,973 mg.mL-1 em comparação a 1,404 mg.mL-1 obtida no
cultivo controle a 28ºC. Assim, a utilização de temperaturas de cultivo mais baixas, próximas
de 20ºC, pode ser considerada a melhor estratégia na otimização da produção de GPV.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/3998 |
| Date | 14 March 2008 |
| Creators | Rossi, Nickeli |
| Contributors | Suazo, Cláudio Alberto Torres |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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