Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-07-29T13:08:16Z
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2013_CatiaValderesSantosFariaLustosa_Parcial.pdf: 3117212 bytes, checksum: b27339620776f31f8a6030cb8dbf3488 (MD5) / A vulnerabilidade de neurônios dopaminérgicos a insultos químicos continua sendo uma questão relevante na neuropatologia. Estudos anteriores revelam aumento dos níveis de interferon gama (IFN- ) e da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) durante a injúria de células neuronais. Entretanto, até o momento, nenhum trabalho avaliou se a nNOS afeta a viabilidade de neurônios dopaminérgicos expostos ao IFN- . Para avaliar o papel da nNOS nas respostas celulares ao IFN- , o presente estudo realizou silenciamento gênico da enzima nNOS via interferência de RNA (RNAi) no modelo de neurodegeneração de células SH-SY5Y. Primeiro, analisou-se o conteúdo de RNAm de nNOS através de PCR em tempo real. Três RNAs interferentes sintéticos curtos foram testados nos tempos de 8h e 24h, em doses de 18,75nM e 37,5nM. Testou-se também um vetor de expressão de grampos curtos de RNA, denominado pnNOS_hum_4400 para o silenciamento da enzima. Os efeitos do silenciamento de nNOS sobre a viabilidade das células SH-SY5Y lesadas foram medidas via ensaio de 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). O melhor efeito de silenciamento de nNOS ocorreu no tempo de 24h pós-transfecção para siRNAnNOShum_3987 e siRNAnNOShum_4400, com diminuição de 0,46 e 0,66 vezes. SiRNAnNOShum_4400 e o vetor pnNOS_hum_4400 aumentaram a viabilidade das células lesadas por IFN-y em 5,0 % e 15,8%, respectivamente. Conclui-se que a enzima nNOS participa de eventos celulares ligados à injúria de células SH-SY5Y causada pelo IFN- y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The vulnerability of dopaminergic neurons to chemical insults remains a relevant issue in neuropathology. Previous studies found increased levels of interferon gamma (IFN- ) and the neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) during neuronal injury. No previous work, however, has evaluated whether nNOS affects the viability of dopaminergic neurons exposed to IFN- . To gain more insight into the role of nNOS in cell responses to IFN- , the present study carried out the enzyme gene silencing by RNA interference (RNAi) in the neuron-like SH-SY5Y model of neurodegeneration. We first analyzed the nNOS mRNA knocking down by using a reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Three small interfering RNAs were tested at 8h and 24h in doses of 18.75nM and 37.5nM. We also tested a short-hairpin RNA expression vector named pnNOS_hum_4400 to improve enzyme knocking-down. nNOS silencing effects on the viability of injured SH-SY5Y cells were measured by the 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The highest knocking down in nNOS mRNA content occurred at 24h post-transfection for siRNAnNOShum_3987 and siRNAnNOShum_4400, with 0.46 and 0.66 fold decrease. SiRNAnNOShum_4400 and the vector pnNOS_hum_4400 ameliorate the viability of cells injured by IFN- 5,0 % 15,8 % ely. We concluded that nNOS enzyme plays at least a partial role in SH-SY5Y cell degeneration caused by IFN-y .
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/13967 |
| Date | 23 May 2013 |
| Creators | Lustosa, Cátia Valderês dos Santos Faria |
| Contributors | Silva, Simoneide Souza, Almeida, Ricardo Titze de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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