Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-09-23T20:54:12Z No. of bitstreams: 1 2008_ValiaBravoEgana.pdf: 2065608 bytes, checksum: 94fcce433a53fcc9451190300b2bdd0b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-12-12T12:48:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_ValiaBravoEgana.pdf: 2065608 bytes, checksum: 94fcce433a53fcc9451190300b2bdd0b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-12T12:48:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_ValiaBravoEgana.pdf: 2065608 bytes, checksum: 94fcce433a53fcc9451190300b2bdd0b (MD5) Previous issue date: 2008 / MicroRNAs (miRNAs) são os produtos gênicos não-codantes (~19-22 nucleotídeos) com um papel chave no regulamento pós-transcricional inibindo a expressão gênica através da união seletiva a seqüências complementares de RNA mensageiro. Nossos resultados indicam que os miRNAs isolados com métodos atualmente usados para preparação de RNA são instáveis assim como também seus cDNAs correspondentes. Estas observações têm grande importância em estudos de análise de expressão de miRNAs. Além, nosso laboratório é pioneiro em determinar perfis específicos de miRNA em ilhotas pancreáticas humanas e de roedores normais assim como em ilhotas expostas à ação de citocinas diabetogênicas pró-inflamatórias. O miR-7 resultou ser o miRNA mais abundante da porção endócrina das ilhota e o miR-375 o mais abundante no pâncreas. Ambos os miRNAs aumentaram sua expressão durante o desenvolvimento pancreático, assim como também, em ilhotas tratadas com citocinas pró-inflamatórias por 6 horas. Estas observações sugerem que o miR-7 e o miR-375 desempenham um papel importante não apenas durante o processo de desenvolvimento e de manutenção do fenótipo das ilhotas mas também nos sinais de sobrevivência nos primeiros estágios da resposta inflamatória. A pesquisa dos miRNAs e de seus mRNAs alvos pode tornar-se uma ferramenta valiosa para o diagnóstico e tratamento de doenças tais como o diabetes. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / MicroRNAs (miRNAs) are non-coding gene products (~19–22 nucleotides) that play a key role in post-transcriptional regulation by inhibiting gene expression through selective binding to complementary messenger RNA sequences. Our early results indicated that miRNAs isolated with currently used methods for RNA preparation are unstable and so are their corresponding cDNAs. These observations should be of great interest to all researches that outsource RNA samples for miRNA gene array analysis. We are first to determine specific miRNA signatures in normal pancreatic islets as well as in islets exposed to pro-inflammatory (diabetogenic) cytokines. MiR-7 emerged as the most abundant endocrine islet miRNA and miR-375 as the most abundant intra-islet miRNA. Both miRNAs increased their expression during pancreatic development as well as in islets treated with pro-inflammatory cytokines for 6 hours. This suggests that miR-7 and miR-375 play an important role not only in development and islet phenotype maintenance but also in the survival signaling at the early inflammatory response. The research of miRNAs and their target mRNAs could be a valuable tool in diagnostics by indicating the early onset of diseases such as diabetes and by finding new therapeutic targets to treat them.

COÊLHO, M. das G. L. Susceptibilidade do camarão-rosa Farfantepenaeus subtilis (Perez-Farfante, 1967) ao vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética (IHHNV). 2006. 38f Dissertação (mestrado em Ciências Marinhas Tropicias) - Instituto de Ciências do Mar, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. / Submitted by Nadsa Cid (nadsa@ufc.br) on 2015-04-16T18:44:25Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_mdasglcoelho.pdf: 981620 bytes, checksum: 259d13d394c652d446132bce3bc27a5f (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid(nadsa@ufc.br) on 2015-04-16T18:44:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_mdasglcoelho.pdf: 981620 bytes, checksum: 259d13d394c652d446132bce3bc27a5f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T18:44:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_mdasglcoelho.pdf: 981620 bytes, checksum: 259d13d394c652d446132bce3bc27a5f (MD5) Previous issue date: 2006 / Diseases are the main biological factor that can limit and discourage the shrimp culture worldwide. Virus infection is the main cause of impact and economic losses registered in this sector. The Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) occurs in both wild and cultured shrimp, mainly in the juvenile and sub-adult phases, although it does not cause harm to human health. This pathogen is considered a low impact virus to Litopenaeus vannamei, causing a chronic disease called "Runt Deformity Syndrome" (RDS), which compromises the product quality and can have economic implications to shrimp industry. This study aimed at verifying response of the native species Farfantepenaeus subtilis in presence of the IHHN virus. The experiment utilized 200 healthy young shrimp weighing 2.56 ± 0.44g (mean ± standard deviation), kept in single 5.5L tanks, under monitored conditions similar to those found in shrimp culture farms. The animals have been challenged in two ways: “per os” and by intramuscular injection, each one with its control group. After three days of exposition to the virus, the animals were fed with a commercial food two times a day, when were observed behavior, mortality, moulting and the signs for the characteristic symptoms in species susceptible to this disease. The experiment was conducted during 30 days. The shrimp were sample randomly for total hemocytes counting, histological and molecular analyses. This study showed that the native species F. subtilis caught in Pacoti River Estuary (Eusébio - Ceará - Brazil) is susceptible to IHHNV infection. / As doenças são consideradas como o principal fator biológico capaz de limitar e desestimular a carcinicultura no mundo. As viroses são, invariavelmente, as que causam maior impacto e, por conseguinte, maiores prejuízos econômicos registrados no setor. O vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética – IHHNV acomete os camarões silvestres e cultivados nas fases jovens e sub-adulta, mas não causa danos à saúde humana. Para a espécie Litopenaeus vannamei é considerado de baixo impacto, levando a uma enfermidade crônica denominada “síndrome da deformidade e do nanismo” (RDS), que compromete a qualidade do produto com implicações econômicas para a indústria camaroneira. O presente estudo teve por objetivo realizar testes de desafio com a espécie nativa do camarão Farfantepenaeus subtilis para verificar o comportamento da mesma frente ao vírus da IHHN. Foram utilizados 200 camarões jovens saudáveis com peso corporal de 2,56 ± 0,44g (média ± desvio padrão; n = 200) mantidos em tanques individuais de 5,5L, em condições monitoradas que reproduziram os parâmetros ambientais de cultivo. Os animais foram desafiados de duas maneiras: um grupo por ingestão de tecido contaminado per os e outro por injeção intramuscular do extrato contendo o vírus, cada qual com seu grupo controle. Os grupos controles tiveram tratamentos semelhantes, porém um grupo ingeriu músculo de camarão IHHNV negativo e outro recebeu extrato de músculo de camarão livre de IHHNV. Após três dias de exposição ao IHHNV, os animais foram alimentados com ração comercial duas vezes ao dia e observados quanto ao comportamento, mortalidade, muda e sintomas já conhecidos em espécies susceptíveis à doença. O experimento teve duração de 30 dias, quando foram colhidas aleatoriamente amostras de material biológico para contagem total de hemócitos, análise histológica e molecular. O estudo demonstrou que a espécie nativa Farfantepenaeus subtilis capturada no Estuário do Rio Pacoti no município de Eusébio, Estado do Ceará é susceptível à infecção pelo vírus da IHHN.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-05Bitstream added on 2014-06-13T19:21:40Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_dc_dr_botib.pdf: 7342126 bytes, checksum: f60231df4de70ed801aa7a9d087f9671 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Uma grande fração do genoma dos eucariotos é constituída de sequências repetitivas, que estão divididas em duas classes. Na primeira classe estão as sequências repetidas em cadeia, (satélites, minissatélites e microssatélites) e na segunda estão as sequências repetidas dispersas, que podem ser divididas em transposons e retrotransposons. Poucos estudos têm sido realizados acerca dessas sequências para elucidar sua função no genoma, que até pouco tempo eram conhecidas como DNA egoísta ou lixo. Porém, estudos recentes tem revelado que essas sequências estão envolvidas na diferenciação cromossômicas sexuais e na organização funcional e estrutural do genoma, além dessas sequências repetitivas constituírem bons marcadores cromossômicos. A subfamília Hypoptopomatina é caracterizada citogeneticamente por apresentar-se conservada quando ao número diplóide, que é de 2n=54 cromossomos para a maioria das espécies analisadas e uma distribuição da hetecocromatina bastante heterogênea, o que torna as espécies dessa subfamília bastante interessantes para os estudos das sequências repetidas, uma vez que essas sequências se localizam preferencialmente em regiões heterocromáticas. No presente trabalho foi estudada a localização de sequências repetidas dispersas Rex1, Rex3 via PCR em quatorze espécies da subfamília Hypoptopomatinae e do elemento disperso HLBa isolado do genoma de Hisonotus leucofrenatus por digestão enzimática. Os elementos Rex1 e Rex3 apresentaram-se conservados no genoma da subfamília Hypoptopomatinae, bem como em espécies distantes filogeneticamente. Tanto Rex1 e Rex3 quanto HLBam se encontram dispersos no genoma, porém este forma blocos em regiões heterocromáticas. Além disso, foi isolado o satélite PTHind do genoma de Pseudotocinclus tientensis, que encontra-se exclusivamente no genoma da espécie isolada, constituindo... / A great fraction of eukaryotic genomic is based on repeated sequences, which are divided in two classes. The first are in tandem (satellites , minisatellites and micro satellites and in the second class are diverse repeated sequences, that can be divided in transposons and retrotransposons. Only few studies had been conducted with these sequences to bring into the light its genomic function, known by the moment as selfish DNA or junk DNA. However, the few researches conducted may indicate that these sequences are related to sexual chromosome deferential and functional and structural genomic organization. In addition, repeated sequences can be used as effective chromosome markers. The subfamily Hypoptopomatinae's cytogenetic characteristics are the conservation of diploid number, which are 2n=54 chromosomes and heterogenic heterochromatic distribution. Based on that, the species of this subfamily became very interesting for analyze and study repeated sequences and also by the fact of these sequences are mostly located in heterochromatic regions. In the present study, Rex1 and Rex3 dispersed repeated sequences were isolated by PCR in fourteen species of Hypoptomatinae subfamily and the dispersed HLBam element was isolated in Hisonotus leucofrenatus genomic by enzymatic digestion. The Rex1 and Rex3 elements are conserved in Hypoptopomatinae subfamily genomic, likewise in phylogenetic distant species. Either Rex1, Rex3 or HLBam are dispersed in genomic, however, in block form inside heterochromatic regions. Moreover, the PTHind satellite was isolated from Pseudotocinclus tientensis genomic, which is exclusively encountered in the genomic of this isolate specie and may be a good marker for the specie. Additionally, sex-specific sequences were isolated by the AFLP technique from the genomic of Hisonotus leucofrenatus females. In Hypoptopomatinae subfamily the major part of current... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-07-29T13:08:16Z No. of bitstreams: 1 2013_CatiaValderesSantosFariaLustosa_Parcial.pdf: 3115952 bytes, checksum: 57e3839be1f01cc4531234cdbb46186a (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: Tânia, Por favor, trocar o arquivo. Obrigada! Jacqueline on 2013-08-01T15:58:31Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-08-06T13:44:14Z No. of bitstreams: 1 2013_CatiaValderesSantosFariaLustosa_Parcial.pdf: 3117212 bytes, checksum: b27339620776f31f8a6030cb8dbf3488 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-16T14:33:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_CatiaValderesSantosFariaLustosa_Parcial.pdf: 3117212 bytes, checksum: b27339620776f31f8a6030cb8dbf3488 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-16T14:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_CatiaValderesSantosFariaLustosa_Parcial.pdf: 3117212 bytes, checksum: b27339620776f31f8a6030cb8dbf3488 (MD5) / A vulnerabilidade de neurônios dopaminérgicos a insultos químicos continua sendo uma questão relevante na neuropatologia. Estudos anteriores revelam aumento dos níveis de interferon gama (IFN- ) e da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) durante a injúria de células neuronais. Entretanto, até o momento, nenhum trabalho avaliou se a nNOS afeta a viabilidade de neurônios dopaminérgicos expostos ao IFN- . Para avaliar o papel da nNOS nas respostas celulares ao IFN- , o presente estudo realizou silenciamento gênico da enzima nNOS via interferência de RNA (RNAi) no modelo de neurodegeneração de células SH-SY5Y. Primeiro, analisou-se o conteúdo de RNAm de nNOS através de PCR em tempo real. Três RNAs interferentes sintéticos curtos foram testados nos tempos de 8h e 24h, em doses de 18,75nM e 37,5nM. Testou-se também um vetor de expressão de grampos curtos de RNA, denominado pnNOS_hum_4400 para o silenciamento da enzima. Os efeitos do silenciamento de nNOS sobre a viabilidade das células SH-SY5Y lesadas foram medidas via ensaio de 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). O melhor efeito de silenciamento de nNOS ocorreu no tempo de 24h pós-transfecção para siRNAnNOShum_3987 e siRNAnNOShum_4400, com diminuição de 0,46 e 0,66 vezes. SiRNAnNOShum_4400 e o vetor pnNOS_hum_4400 aumentaram a viabilidade das células lesadas por IFN-y em 5,0 % e 15,8%, respectivamente. Conclui-se que a enzima nNOS participa de eventos celulares ligados à injúria de células SH-SY5Y causada pelo IFN- y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The vulnerability of dopaminergic neurons to chemical insults remains a relevant issue in neuropathology. Previous studies found increased levels of interferon gamma (IFN- ) and the neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) during neuronal injury. No previous work, however, has evaluated whether nNOS affects the viability of dopaminergic neurons exposed to IFN- . To gain more insight into the role of nNOS in cell responses to IFN- , the present study carried out the enzyme gene silencing by RNA interference (RNAi) in the neuron-like SH-SY5Y model of neurodegeneration. We first analyzed the nNOS mRNA knocking down by using a reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Three small interfering RNAs were tested at 8h and 24h in doses of 18.75nM and 37.5nM. We also tested a short-hairpin RNA expression vector named pnNOS_hum_4400 to improve enzyme knocking-down. nNOS silencing effects on the viability of injured SH-SY5Y cells were measured by the 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The highest knocking down in nNOS mRNA content occurred at 24h post-transfection for siRNAnNOShum_3987 and siRNAnNOShum_4400, with 0.46 and 0.66 fold decrease. SiRNAnNOShum_4400 and the vector pnNOS_hum_4400 ameliorate the viability of cells injured by IFN- 5,0 % 15,8 % ely. We concluded that nNOS enzyme plays at least a partial role in SH-SY5Y cell degeneration caused by IFN-y .

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-25T13:01:16Z No. of bitstreams: 1 2012_LuanaSalgadoQuilici.pdf: 11627198 bytes, checksum: db0d5e877103552a600a1f29f103e6b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-25T13:01:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LuanaSalgadoQuilici.pdf: 11627198 bytes, checksum: db0d5e877103552a600a1f29f103e6b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T13:01:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LuanaSalgadoQuilici.pdf: 11627198 bytes, checksum: db0d5e877103552a600a1f29f103e6b1 (MD5) / Visando a continuidade dos estudos referentes à modulação da expressão gênica em células de mamífero, no presente trabalho foram construídos promotores sintéticos contendo intron A completo (IAs) e deletado em 200 (?200s) e em 600 pb (?600s), dirigindo a expressão do gene repórter da luciferase e do anticorpo (Ab) recombinante, fragmento FvFc, anti-CD3 (pCO). O intron sintético teve sítios de restrição alterados a fim de facilitar processos de clonagem e promover a manutenção do sítio aceptor de splicing na construção ?600s. Estas construções foram transfectadas de forma transiente em células CHO-K1, e a expressão do Ab também foi analisada em população mista estável. Verificou-se que as construções sintéticas mostraram resultados similares para a expressão do gene repórter da luciferase, exceto para a construção ?600. Para esta construção específica, a versão sintética teve rearranjos de sítios de restrição que preservaram o sítio aceptor de splicing. Dessa forma, na comparação dos resultados de expressão das construções de luciferase com promotores contendo IA original e sintético, a atividade da luciferase na versão sintética teve aumento significativo de quase 4 vezes, levando à hipótese de que o splicing do IA está diretamente relacionado ao efeito de melhoramento da expressão do gene repórter. Ao analisar a expressão do Ab anti-CD3, ao contrário, não se observou o aumento esperado nas construções com intron, sendo a construção contendo o promotor sem intron a que apresentou maior detecção de Ab secretado. Testou-se também os níveis de expressão do mRNA do Ab anti-CD3 por qPCR, onde se verificou que, para as construções com intron, apesar da baixa detecção do Ab secretado, havia alta expressão do mRNA correspondente. Esse resultado indica que a grande quantidade de mRNA produzida pode não estar sendo devidamente processada e traduzida, levando à retenção da proteína na célula. Com isso, foi mostrado que o IA e suas deleções inovadoras podem melhorar a expressão gênica, sendo ferramentas importantes para a otimização da expressão de proteínas de interesse comercial em células de mamífero. _________________________________________________________________________________ ABSTARCT / In this study we have designed different synthetic promoters containing the full intron A (IAs), and the deletions of 200 (? 200s) and 600 bp (? 600s), directing the luciferase and recombinant anti-CD3 antibody (Ab) expression (pCO). These constructs were transiently transfected on CHO-K1 cells, and the Ab expression was analysed also by stable production on a mixed population. The synthetic constructs showed similar luciferase activity results compared to the wild-type construct, except by the ?600 construct. Regarding this specific construct, the synthetic version has restriction sites rearrangements to preserve the acceptor splicing site. Thus, comparing the luciferase expression among the wild-type and synthetic ?600 construct, the luciferase activity has increased significantly, leading to a hypothesis that the improvement of gene reporter expression is directly correlated to the IA splicing. On the contrary, when we analysed the anti-CD3 Ab expression, we did not observe the increment of protein expression, with the intronless construct being the more productive one. The anti-CD3 Ab mRNA levels were detected by qPCR. For the intron-containing constructs, despite the low levels of secreted Ab, there was high expression of corresponding mRNA. This result indicates that the great amount of mRNA produced was not correctly processed and translated, leading to protein retention inside the cell. Overall, we demonstrated that the IA and its innovative deletions can improve gene expression, being important tools for protein expression in mammalian cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-09-29T18:45:29Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Viviane Furlan.PDF: 1488185 bytes, checksum: 9382c9b43bf0e5df184ad2e6b2f4035d (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-04T22:29:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Viviane Furlan.PDF: 1488185 bytes, checksum: 9382c9b43bf0e5df184ad2e6b2f4035d (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-04T22:29:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Viviane Furlan.PDF: 1488185 bytes, checksum: 9382c9b43bf0e5df184ad2e6b2f4035d (MD5) Previous issue date: 2008-03 / A proteína CTLA-4 é expressa principalmente em células T ativadas, possuindo um papel fundamental na resposta imune, exercendo efeito regulador na ativação de célula T através da sua ligação com as moléculas da família B7, as quais são expressas em células apresentadoras de antígenos. Polimorfismos no gene CTLA-4 têm sido associados a várias doenças autoimunes e, recentemente, à doenças neoplásicas e infecciosas. A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica, causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. As manifestações clínicas desta doença estão associadas a vários fatores como a secreção alterada de citocinas, hipergamaglobulinemia, e depressão da imunidade celular, sendo que a hiporesponsividade é também atribuída a uma maior expressão de CTLA-4 em células T de pacientes quando comparados a indivíduos controles. O presente trabalho teve por objetivo estudar a possível associação dos SNPs -318C/T na região promotora e +49A/G do éxon 1 do gene CTLA-4 com a PCM. Para isso, 74 pacientes com PCM e 76 indivíduos controles provenientes de regiões distintas do País tiveram suas freqüências alélicas e genotípicas determinadas. A comparação das freqüências genotípicas e alélicas, entre os grupos pacientes e controles, não mostrou diferenças significativas que pudessem associar o polimorfismo dos SNPs -318 e +49 do gene CTLA-4 com a PCM. A análise dos resultados referentes às freqüências haplotípicas obtidas mostrou que existe um forte desequilíbrio de ligação (D'=1) entre os SNPs -318 e +49 para os dois grupos estudados. Porém, a análise realizada não revelou diferenças significativas entre as freqüências haplotípicas dos grupos. Outro ponto importante analisado foi o estudo da estrutura genética (ancestralidade) dos grupos de pacientes e controles. Verificou-se que há predomínio de ancestralidade européia sobre as ancestralidades ameríndia e africana em ambos os grupos. Através desses resultados foi possível determinar que a população utilizada no estudo é geneticamente homogênea, e que o resultado negativo da associação detectado para o gene CTLA-4 e a PCM não está relacionado a ancestralidade da amostragem. Este trabalho demonstra que não foi observada nenhuma associação entre o polimorfismo dos SNPs -318 e +49 do gene CTLA-4 com a resistência e/ou susceptibilidade à Paracoccidioidomicose.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-03-09T20:04:02Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Luana Salgado Quilici.pdf: 1672205 bytes, checksum: 72f099a1e67e9f5c8c2d7a7f89b09263 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-09T23:12:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Luana Salgado Quilici.pdf: 1672205 bytes, checksum: 72f099a1e67e9f5c8c2d7a7f89b09263 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-09T23:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Luana Salgado Quilici.pdf: 1672205 bytes, checksum: 72f099a1e67e9f5c8c2d7a7f89b09263 (MD5) Previous issue date: 2008 / Foram construídos plasmídios com o promotor de CMV sem intron (pGLCMVI), com intron A (IA) completo (pGLCMV) e deletado em 200 (pGLCMV∆200), 400 (pGLCMV∆400) e 600 pb (pGLCMV∆600), dirigindo a expressão do gene repórter da luciferase, além de diferentes seqüências indutoras de ZDNA localizadas a montante do promotor. Estas construções foram transfectadas de forma transiente em células CHO-K1, COS-7, HepG2 e HEK-293. O IA aumentou em 100 a 1.000 vezes a atividade da luciferase em relação à construção sem intron, dependendo da linhagem celular testada. Dentre as versões deletadas do intron, a construção pGLCMV∆200 foi a mais eficiente, aumentando de 3 a 6 vezes a atividade da luciferase, seguida da construção pGLCMV∆600, cuja atividade melhorou em até 4 vezes, comparado com o IA selvagem. Entretanto, a remoção de 400 pb do IA resultou na redução da expressão gênica a níveis quase comparados aos da construção sem IA. Tomados em conjunto, esses dados sugerem a existência de uma região de ligação a um fator transcricional de inibição no fragmento de 200 pb. Os dados da atividade da luciferase foram corroborados com experimentos de RT-qPCR, que relacionaram o aumento da atividade da enzima com o aumento da expressão do gene nas diferentes construções testadas. O splicing nas construções com IA deletado foi estudado por RTPCR, mostrando que há evidências de que não há processamento correto dos exons 1 e 2 de CMV quando o sítio aceptor é removido. Foi estudado o efeito da remoção da região 5’ do promotor de CMV em CHO-K1 e COS-7, que resultou em uma redução de 50% da atividade da luciferase. Dentre os vetores contendo as seqüências indutoras de Z-DNA que também foram transfectados de forma transiente em CHO-K1, apenas naquele em que foi clonada a seqüência Z3 observou-se um aumento de 50% na atividade da luciferase comparado com a seqüência-controle Z5. Foram desenvolvidos clones estáveis de CHO-K1 com esta construção a fim de verificar o potencial de formação de Z-DNA desta seqüência na região adjacente ao promotor. Nestes clones estáveis, transfectou-se de forma transiente o plasmídeo pMACIA scFvZ22 NLS, um fragmento de anticorpo anti-Z-DNA. A atividade da enzima aumentou em 3 vezes quando este elemento em trans foi adicionado ao sistema de expressão, indicando que esta seqüência realmente forma Z-DNA e que a modulação da expressão gênica ocorre em níveis transcricionais. Portanto, neste trabalho foi mostrado que o IA e suas deleções inovadoras, bem como seqüências indutoras de Z-DNA, podem melhorar a expressão gênica, sendo ferramentas importantes para a otimização da expressão de proteínas de interesse comercial em células de mamífero. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / It had been constructed plasmids with the promoter of CMV and the luciferase reporter gene comprising the following features: without the CMV intron A (IA) (pGLCMV I-), with the full IA (pGLCMV) or the deleted versions of it (pGLCMV∆200, pGLCMV∆400 and pGLCMV∆600), and Z-DNA inducer sequences upstream the promoter. These constructions had been transiently transfected in CHOK1, COS-7, HepG2 and HEK-293 cells. The whole intron A resulted in a 100 to 1000- fold increase in the activity of luciferase compared to the intronless version, depending on the cell line tested. The pGLCMV∆200 construction had also enhanced in 3 to 6-fold the luciferase activity compared to the wild-type IA. Following the results obtained with the construction above, the IA deleted in 600 pb had improved the luciferase activity no more than 4 times, depending on the cell line used. The pGLCMV∆400 construction, instead, resulted in a reduction of gene expression to levels similar to the intronless construction. Taken together, these data suggest that there are a binding region for an inhibitory transcription factor comprising the 200 pb fragment. The data of the activity of luciferase had been corroborated with experiments of RT-qPCR, which had correlated the increases of luciferase activity for the different constructions above with the increase of the expression of the gene of luciferase. To verify the effect of splicing in the constructions with the deleted IA, a RT-PCR experiment was carried through showing that the removal of the donor splicing site might have a relation with the incorrect processing of exons 1 and 2 of the CMV IE gene. Amongst the Z-DNAinducer sequences cloned upstream the CMV promoter, the Z3 sequence resulted in a 2- fold increase of the transient luciferase activity when compared to the control-sequence Z5. As a result, it had been developed stable clones of CHO-K1 cells with this sequence in order to verify if the sequence in question exerts its activity by means of the formation of Z-DNA in the adjacent region to the promoter. In these stable clones, it had been transiently transfected the pMACIA scFvZ22NLS plasmid, that codes for an antibody fragment anti-Z-DNA. The values of the luciferase activity had increased 3 times when this element in trans it was added to the expression system, indicating that this sequence really forms Z-DNA and that the effect observed occurs in transcriptional levels. Therefore, in this work it was shown that the intron A and its innovative deletions, as well as Z-DNA-inductive sequences, can improve the gene expression, being important tools for the optimization of clinical relevant protein expression in mammalian cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-24T18:21:07Z No. of bitstreams: 1 2009_FernandaMartinsSiqueira.pdf: 1560299 bytes, checksum: 1d720db84287abde6df9b47eb0f9ac38 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:48:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_FernandaMartinsSiqueira.pdf: 1560299 bytes, checksum: 1d720db84287abde6df9b47eb0f9ac38 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_FernandaMartinsSiqueira.pdf: 1560299 bytes, checksum: 1d720db84287abde6df9b47eb0f9ac38 (MD5) Previous issue date: 2009 / Os anticorpos anti-DNA são comumente encontrados nas doenças auto-imunes. Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de se determinar as bases moleculares desse reconhecimento antigênico. Em trabalhos anteriores construíu-se uma biblioteca combinatória de fragmentos de anticorpos, a partir de cDNA de galinhas da raça Red/Black Cornish Cross, previamente imunizadas com BSA-fluoresceína. Os scFvs foram selecionados pela sua capacidade de ligação a DNA fita simples (Oligo dT-celulose) (Maranhão, 2001). A partir daí, quatro clones foram escolhidos. Esses scFvs foram novamente seqüenciados e analisados. Os fragmentos de anticorpos foram produzidos no sobrenadante de cultura de bactéria e posteriormente purificados por cromatografia de afinidade utilizando colunas de níquel. Para a confirmação da atividade ligante a ácidos nucléicos, bem como para a caracterização de sua afinidade e especificidade, essas proteínas foram submetidas à imunoensaios. A afinidade foi testada tanto por ELISA de ligação direta, onde o único antígeno utilizado era o Oligo dTbiotina, quanto por ELISA de competição. Neste último tipo de imunoensaio foram utilizados diversos ssDNA solúveis como competidores: Oligo dT, Oligo dA, Oligo dC, Oligo dG, Oligo dU. Além disso, dois desses scFvs foram testados quanto à capacidade de inibição da ligação a Oligo-dT pelo antígeno originalmente utilizado (FITC) para a imunização dos animais. As análises realizadas nesse trabalho mostram que os scFvs são capazes de se ligar ao antígeno utilizado na seleção da biblioteca. Além disso, existe uma dependência da composição das CDRs e a capacidade de reconhecimento dos Ac recombinantes de diferentes seqüências de DNA fita simples. Nesse sentido, um dos scFvs caracterizados apresentou uma grande polirreatividade, ligando-se a diferentes antígenos, enquanto que os outros três apresentaram ligação significativa apenas a Oligo-dT e a Oligo-dA, dentre os oligonucleotídeos testados. Também é de tamanha relevância o achado de que mesmo tendo sido obtidos a partir de uma seleção por afinidade a Oligo-dT, a ligação ao antígeno utilizado para a imunização dos animais (FITC) é mantida para os dois fragmentos de Ac testados. Todos esses dados sugerem que a afinidade e a especificidade desses fragmentos de anticorpos dependem não só da interação deste com o esqueleto de açúcar-fosfato, mas também com as bases nitrogenadas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Anti-DNA antibodies are commonly found in autoimmune disease patient sera. Several studies are made trying to understand their origin and the basis of their affinity. We had previously constructed a scFv library from BSA-fluorescein chicken immunized Ab repertoire and used it to select anti-ssDNA antibodies. Several clones were analyzed in terms of scFv production and VH and VL sequences, and among them, four representatives ones were chosen for further characterization. The aim of this work was to produce and characterize the selected scFvs in terms of theirs immunological features, comparing their specificities. The recombinant scFvs were produced in bacterial culture supernatants and were purified using metal affinity chromatography. The purified proteins were tested by ELISA immunoassays for ssDNA direct binding. The purified scFvs were also tested by ELISA immunoassays for ssDNA competition using soluble ssDNA: Oligo-dA, Oligo-dC, Oligo-dG, Oligo-dT, Oligo-dU. We also tested the remaining binding to FITC. The protein production and purification yielded enough recombinant products for immunological characterization. The recombinant affinity-purified products were able to bind to Oligo(dT)-biotin and this association was inhibited by Oligo-dT itself, Olig-dA and Oligo-dU. Also, for the two tested scFvs, FITC was able to compete with Oligo-dT-biotin binding. Although quite similar to the other scFvs, one of the characterized proteins showed a strong polyreactivity. These data showed that we were able to select specific antibodies fragments anti-ssDNA from a nonimmune source. The antibodies produced in bacterial cells relied their binding activity not only on sugar-phosphate backbone, but also on nitrogenous base recognition.

Tese (doutorado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-02-25T20:22:22Z No. of bitstreams: 1 2010_SaletedaSilvaRios.pdf: 2330864 bytes, checksum: ba31c2ddc03194240de86fc8a653433b (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-03-01T15:20:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_SaletedaSilvaRios.pdf: 2330864 bytes, checksum: ba31c2ddc03194240de86fc8a653433b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-01T15:20:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_SaletedaSilvaRios.pdf: 2330864 bytes, checksum: ba31c2ddc03194240de86fc8a653433b (MD5) / A instabilidade de microssatélites tem se mostrado importante na patogênese molecular do carcinoma de endométrio. Apesar do pólipo endometrial ter sido implicado com a neoplasia de endométrio, ainda não está claro se a instabilidade de microssatélites desempenha algum papel na gênese do pólipo endometrial uterino. O objetivo deste estudo foi estimar a prevalência da instabilidade de microssatélites no pólipo endometrial e avaliar se existem parâmetros clínicos e histopatológicos que possam estar associados a este tipo de instabilidade. Entre setembro/2008 a abril/2009, pólipos endometriais de 109 pacientes foram coletados. A instabilidade de microssatélites foi pesquisada utilizando-se os marcadores recomendados pelo National Câncer Institute (NCI), a saber BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 e o D17S250. Foi realizada análise histopatológica e as informações clínicas foram obtidas dos prontuários das pacientes. Foram detectadas instabilidade de microssatélites em 7 das 109 amostras válidas (6.4%). Destas, 6 foram positivas para instabilidade com o marcador D17S250 e uma com o D5S346. Todas as amostras apresentaram baixa instabilidade. Não houve diferença na instabilidade de microssatélites com relação às seguintes variáveis: idade, índice de massa corpórea, menarca, paridade, abortamento, menopausa e uso de terapia de reposição hormonal. A instabilidade de microssatélites ocorreu mais freqüentemente em pólipos hiperplásicos (3/20;15%) do que em pólipos endometriais comuns (4/86;4.6%) e para pacientes com múltiplos pólipos houve um aumento marginal, porém estatisticamente não significante na freqüência de instabilidade de microssatélites (p>0. 07). Este é o primeiro estudo de instabilidade de microssatélites em pólipo endometrial uterino com uma amostra de 109 pacientes, com material obtido através de histeroscopia. A instabilidade genética foi infreqüente no pólipo endometrial uterino. Apesar desta alteração ter sido mais freqüente em pólipos hiperplásicos sem atipia e em múltiplos pólipos, isto não se demonstrou estatisticamente significante. Investigações adicionais e seguimento de longo prazo serão necessários para avaliar os resultados oncológicos destas pacientes. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Microsatellite instability (MSI) has been shown to be important in the molecular pathogenesis of endometrial carcinoma. However, although endometrial polyps have been associated with endometrial carcinoma, it is still unclear whether MSI may play a role in endometrial polyp. The objective of this study was to estimate the prevalence of MSI in endometrial polyp and to evaluate whether there are clinical and histopathological parameters that are associated with this kind of instability. Between September/2008 and April/2009, endometrial polyps were collected from 109 patients. MSI was evaluated using the National Cancer Institute-recommended markers BAT25-BAT26-D2S123-D5S346 and D17S250. Histopathological analysis was performed, and clinical information was obtained from patients’ records. MSI low was detected in 7/109 validated samples (6.4%). Of these, six were positive for instability at D17S250, while one at D5S346. There were no significant differences between endometrial polyps with and without MSI with regard to age, Body Mass Index, menarche, parity, miscarriage or menopause. However, MSI was more frequent in simple hyperplastic polyps without atypia (3/20; 15%) than in benign polyps (4/86; 4.6%) and, for patients with multiple polyps, had a marginal but statistically insignificant increase in the frequency of MSI (p<0.07). This is the first prospective study of MSI in endometrial polyp in a population of 109 patients with samples obtained by hysteroscopy. MSI was infrequent in endometrial polyps. Although MSI appears to be more frequent in multiple and/or simple hyperplastic polyps without atypia it was not statistically significant. Further investigations and long term follow up are required to evaluate the oncologic outcomes of such patients.

Orientador: Solange Bento Farah / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T17:40:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lee_WenHwa_M.pdf: 7950733 bytes, checksum: 1fc52b1af5dd019706bfa02a61b6a704 (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado / Genetica Humana