Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-10-19T16:55:50Z
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Previous issue date: 2008 / Baculovírus são vírus de inseto com grande potencial de uso em programas de
controle biológico principalmente devido ao seu apelo ecológico, uma vez que são
altamente específicos ao inseto alvo e não apresentam toxicidade ao homem e ao meio
ambiente. Sua produção tem sido feita basicamente pela sua multiplicação no inseto
hospedeiro. Porém, a produção de baculovírus em cultivos celulares oferece vantagens
em relação à multiplicação in vivo por ser um sistema controlável, estéril, com alta
pureza do produto e por dispor de centenas de linhagens de células de inseto
estabelecidas. No entanto, sucessivas passagens do vírus em cultura de células podem
resultar em alterações genéticas levando à perda de virulência. A alteração mais comum
refere-se à formação de mutantes FP (Few Polyhedra) devido a mutações no gene 25k
fp. O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV)
vem sendo utilizado com sucesso como agente de controle da lagarta da soja (A.
gemmatalis). Entretanto, sua produção tem sido feita in vivo e pouco se conhece sobre
sua produção em cultivos celulares. Nesse trabalho, os efeitos causados pela passagem
do vírus AgMNPV em células BTI-Tn-5B1-4 foram estudados. A porcentagem de
células contendo muitos poliedros manteve-se alta e constante até a quinta passagem. A
partir desse ponto houve uma redução significante na quantidade de células com muitos
poliedros com concomitante aumento na quantidade de células com poucos poliedros.
Em paralelo, houve um dramático aumento no título viral pela produção de vírus
extracelulares (budded virus). Todos esses parâmetros associados à análise
ultraestrutural caracterizam a geração de mutantes FP durante a passagem serial do vírus
em cultura de células. Adicionalmente, os perfis de restrição do DNA viral obtido em
diferentes passagens mostraram similaridade revelando a ausência de grandes
modificações genéticas, como deleções e inserções no genoma do vírus. A indicação da
presença de alterações menores como mutações pontuais no locus do gene 25k fp foi
comprovada pela determinação da sequência nucleotídica deste gene nos mutantes
selecionados (sobrenadante da sétima passagem). Mutações pontuais foram detectadas
em três clones (FP1, FP3, FP4) na região do gene 25k fp, incluindo sua região
promotora, sendo que apenas um clone (FP5) não apresentou qualquer alteração nesse
gene. Com base na cinética de síntese de proteínas utilizado marcação radioativa, uma
redução na síntese da poliedrina (principal componente protéico dos corpos de oclusão)
foi também observada em todos os clones do tipo FP em comparação com o vírus
padrão. Além disso, a análise ultraestutrural dos clones FP revelou características típicas
de formação de mutantes FP como células com poucos ou nenhum poliedro, produção
de poliedros amorfos com baixo número de virions e formação de estroma virogênico
com intensa produção de nucleocapsídeos. Finalmente, variantes Many Polyhedra
(MP), apresentando um maior número de poliedros por célula e um título de budded
virus similar ao vírus parental, foram selecionados como parte de uma estratégia para
produção do vírus em escala maior em cultivos celulares (biorreatores). _________________________________________________________________________________________
ABSTRACT / Baculovirus are insect viruses with great application potential for biological
control programs due mainly to their ecological appeal, once they are highly specific to
the host insect and do not present toxicity to man and to the environment. Their
production has been made basically by their multiplication in host insects. Nevertheless,
baculovirus production in cell cultures offers advantages over the in vivo multiplication
for being a controllable, sterile, high pureness product yield process besides the fact of
hundreds of cell lines being already established. However, successive passages of the
virus in cell culture result in genetic alterations leading to loss of virulence. The most
common alteration is the FP (Few Polyhedra) mutants formation due to mutations in the
25k fp gene. Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV)
baculovirus is being used successfully as control agent of the soybean caterpillar (A.
gemmatalis). However, its production has been made in vivo and little is known on its
production in cell cultures. In this work, the effects caused by the passage of the
AgMNPV in BTI-Tn-5B1-4 cells was studied. The percentage of cells containing many
polyhedra remained high and constant until the fifth passage. From this point on there
was a significant reduction in the amount of cells with many polyhedra with
concomitant increase in the amount of cells with few polyhedra. In parallel, there was a
dramatic increase in the viral titer by production of extracellular virus (budded virus).
All these parameters associated to the ultra structural analysis characterize the FP
mutants generation during serial passage of the virus on cell culture. Additionally, there
was similarity in the viral DNA restriction endonuclease digestion profile of different
passages reveling no significant genetic modifications, such as deletions and insertions.
The indication that small alterations, such as point mutations, present in the 25k fp gene locus was confirmed by this gene nucleic sequence determination in the selected
mutants (seventh passage of supernatant). Point mutations in the 25k fp gene region
were detected in three clones (FP1, FP3 and FP4), including its promoter region, and
only one clone (FP5) did not present any alteration in this gene. Based on the protein
synthesis kinetics using radioactive labeling, a reduction in the polhyedrin synthesis (the
main component of the occlusion bodies) in all FP clones was also observed in
comparison to the standard virus. Moreover, the ultra structural analysis of the FP
clones disclosed typical characteristics of FP mutants formation such as cells with few
or no polyhedra, amorphous polyhedra production with low virions number and
virogenic stroma formation with intense nucleocapsid production. Finally, Many
Polyhedra (MP) variants, presenting a larger number of polyhedra per cell and a similar
to the parental virus budded virus titer, were selected as part of a strategy for a larger
viral scale up production in cell culture (bioreactors).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/2476 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Rezende, Syomara Hakiko Matusita Soares de |
| Contributors | Souza, Marlinda Lobo de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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