Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2018. / Submitted by Robson Amaral (robsonamaral@bce.unb.br) on 2018-05-11T15:04:54Z
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2018_AnaLauraAlfonsoPérez.pdf: 2516747 bytes, checksum: b579caf86dfe900c3615afb57174b809 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O sistema de expressão baseado na utilização da levedura Komagataella phaffii tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. Uma das proteínas de grande interesse na indústria biofarmacêutica e cosmética é o fator de crescimento epidermal humano (hEGF). O objetivo desse estudo foi desenvolver um sistema para a produção de hEGF na levedura K. phaffii. Para isso foram utilizados os peptídeos sinais dos genes αF, SUC2 e PHO1. Três vetores foram construídos, cada um deles contendo um dos peptídeos sinal. Foram construídos os vetores de expressão sob o controle do promotor do PGK1 e utilizados para transformação de K. phaffii M12-K, uma linhagem mutante para o gene KEX1. Os clones recombinantes foram confirmados por PCR de colônia e foram crescidos em meio mínimo para avaliar a cinética de crescimento. Os clones positivos foram selecionados e utilizados na expressão em frasco empregando meio complexo. A presença do hEGF foi avaliada por SDS-PAGE e confirmada por Western blot na presença de um anticorpo específico. Com isso, um clone de cada sistema foi escolhido para a purificação do hEGF por cromatografia de exclusão molecular e RP-HPLC. A partir desses experimentos foi confirmada a presença do hEGF e o polipeptídeo foi parcialmente purificado. Finalmente, foi escolhido o clone 1αF para otimizar o processo de purificação, adicionando uma etapa em HILIC. O hEGF foi satisfatoriamente purificado. O tamanho correto e a sequência do N-terminal igual ao EGF presente em humanos foram confirmados por espectrometria de massas e sequenciamento automático. Os resultados obtidos mostram que o hEGF foi produzido com sucesso em K. phaffii com a sequência primária correta. / The expression system based on the utilization of the yeast Komagataella phaffii has been used successfully used in the production of a large variety of heterologous proteins. This yeast combines several important features such as easy molecular manipulation, rapid cell growth, ability to perform post-translational modifications and efficient secretion of proteins, in addition to large heterologous protein production at high cell densities. One of the proteins of great interest in the biopharmaceutical and cosmetic industry is the human epidermal growth factor (hEGF). The aim of this study was to develop a system for hEGF production in K. phaffii. For this, the 3 different signal peptides sequences from genes αF, SUC2 and PHO1 were tested. Three vectors were constructed, each containing one of the signal peptides. Expression vectors were constructed under the control of the PGK1 promoter and used for transformation of K. phaffii M12-K, a strain mutant for the KEX1 gene. Recombinant clones were confirmed by colony PCR and grown in minimal medium to evaluate growth kinetics. Positive clones were selected and used in flask expression using complex media. The presence of hEGF was assessed by SDS-PAGE and confirmed by western blot with a specific antibody. One clone from each system was chosen for the production and purification of hEGF by molecular-exchange chromatography and RP-HPLC. From these experiments the presence of hEGF was confirmed and the polypeptide was partially purified. Finally, clone 1αF was chosen to optimize the purification process by adding one step in HILIC. The hEGF was successfully purified. Correct size and N-terminal sequence equal to EGF present in humans were confirmed by mass spectrometry and Edman sequencing. Together, our results show that hEGF was successfully produced in K. phaffii with the proper primary structure. / El sistema de expresión basado en la utilización de la levadura Komagataella phaffii ha sido utilizado con éxito en la producción de una gran variedad de proteínas heterólogas. Esta levadura reúne características como fácil manipulación molecular, rápido crecimiento celular, capacidad de realizar modificaciones pos-traduccionales y eficiente secreción de proteínas, además de llegar hasta altas densidades celulares con elevada producción heteróloga. Una de las proteínas de gran interés en la industria biofarmacéutica y cosmétic es el factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF). El objetivo de este estudio foi desarrollar un sistema para la producción de hEGF en la levadura K. phaffii. Para eso fueron utilizadas los péptidos señales de los genes αF, SUC2 e PHO1. Fueron construidos tres vectores, cada uno de ellos conteniendo una de las sequencias señales. Los vectores fueron construidos sobre el control del promotor del gen PGK1 y fueron utilizados para la transformación de la cepa M12-K de K. phaffii, que es mutante para el gen KEX1. Los clones recombinantes fueron confirmados mediante PCR de colonias y fueron crecidos en medio mínimo para analizar la cinética de crecimiento. Los clones positivos fueron seleccionados y utilizados para expresión en frasco utilizando medio complejo. La presencia de hEGF fue analizada por SDS-PAGE e confirmada por western blot en presencia de un anticuerpo específico. A partir de ahí, una muestra de cada sistema fue escogida para la purificación de hEGF utilizando cromatografía de exclusión molecular y RP-HPLC. A partir de esos experimentos fue confirmada la presencia de hEGF y el polipeptídeo fue parcialmente purificado. Finalmente, fue escogido el clon 1αF para optimizar el proceso de purificación, adicionando una cromatografía en HILIC. El hEGF fue satisfactoriamente purificado. El tamaño correcto y la secuencia del N-terminal igual al EGF presente en humanos fueron confirmados por espectrometría de masas y sequenciamiento automático. Los resultados obtenidos muestran que fue producido hEGF en K. phaffii, con la sequencia primária correcta.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/32075 |
| Date | 28 February 2018 |
| Creators | Alfonso Pérez, Ana Laura |
| Contributors | Torres, Fernando Araripe Gonçalves |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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