Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-31T18:25:44Z
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Previous issue date: 2018-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ). / O objetivo desta pesquisa foi avaliar as atividades antimicrobiana e anti-inflamatória de vouacapanos de Pterodon emarginatus Vogel (Fabaceae). Foram utilizados frutos coletados nos municípios de Campestre e Bela Vista de Goiás (Estado de Goiás, Brasil). Somente na oleorresina dos frutos de Bela Vista de Goiás foram detectados diterpenos vouacapânicos e por isso essa amostra foi fracionada por partição. A fração diclorometano:hexano da oleorresina foi submetida a cromatografia em coluna aberta. Foi utilizada como fase estacionária Diaion HP-20 e como fase móvel acetonitrila:água, com força de eluição crescente. Foi desenvolvido um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para monitorar o fracionamento cromatográfico. As subfrações 7-12 (Grupo 1) foram reunidas e submetidas à separação por CLAE semi-preparativa em fase reversa. A atividade antimicrobiana dos vouacapanos e da oleorresina de Pterodon foi determinada frente a 8 cepas Gram-positivas, 11 cepas Gram-negativas e 4 espécies de Candida por meio do ensaio de microdiluição em placa. A citotoxicidade foi avaliada em células HaCaT pelo método colorimétrico do MTT - brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-ila)-2,5-difeniltetrazólio)]. O potencial anti-inflamatório foi determinado pelas seguintes avaliações: atividade inibitória frente à fosfolipase A2 por método fluorimétrico, expressão de COX-2 e NRF2, e quantificação das citocinas inflamatórias IL-6 e IL-8 por citometria de fluxo. As amostras foram testadas nas concentrações que mantiveram a viabilidade de 90% (CV90) das células HaCaT, para evitar o uso de concentrações citotóxicas nos ensaios anti-inflamatórios. Três compostos foram identificados via RMN: 6α,19β-diacetoxi-7β,14β-diidroxivouacapano (V1), 6α-acetoxi-7β,14β-diidroxivouacapano (V2) e 6α-acetoxi-7β-hidroxivouacapan-17β-oato de metila (V3). Os três vouacapanos e a oleorresina foram mais ativos frente às cepas Gram-positivas. Com relação às cepas Gram-negativas, as amostras testadas se mostraram ativas apenas frente à Pseudomonas aeruginosa. O vouacapano V2 foi o que exibiu melhor atividade antibacteriana, apresentando-se ativo frente a 7 das 8 bactérias Gram-positivas avaliadas, com valores de concentração inibitória mínima entre 62,5 e 125 μg/mL. As amostras testadas não apresentaram atividade inibitória frente às cepas C. glabrata, C. kruzei, C. parapsilosis e C. albicans. A oleorresina e os vouacapanos V1, V2 e V3 apresentaram CV90 de 7,5 μg/mL, 19,0 μg/mL, 13,8 μg/mL e 4,00 μg/mL, respectivamente, frente às células HaCaT. A oleorresina de Pterodon e os vouacapanos V2 e o V3 inibiram a atividade da fosfolipase A2 em 30,78%, 24,96% e 77,64%, respectivamente. Foi observado que os vouacapanos V2 e V3 nas CV90 inibiram a expressão de COX-2 em 28,3% e 33,17%, respectivamente. A oleorresina de sucupira foi capaz de inibir a produção de IL-6 em 35,47%. A expressão de NRF2 e a produção de IL-8 não foram alteradas pelas substâncias testadas, em relação ao controle. Os resultados dão sustentação ao uso popular dos frutos de sucupira como antibacteriano e anti-inflamatório e mostram que estas atividades podem estar associadas à presença de vouacapanos. / This research aimed to evaluate the antimicrobial and anti-inflammatory activities of Pterodon emarginatus Vogel (Fabaceae). The fruits were collected in the municipalities of Campestre and Bela Vista de Goiás (State of Goiás, Brazil). Diterpene vouacapanes were detected only in the oleoresin of the fruits of Bela Vista de Goiás, and so this sample was fractionated by partition. The dichloromethane: hexane fraction of this oleoresin was subjected to open column chromatography. Diaion HP-20 was the stationary phase and the mobile phase was acetonitrile: water with increasing elution force. An HPLC method was developed in order to monitor chromatographic fractionation. Subfractions 7-12 (Group 1) were pooled and subjected to reverse-phase semi-preparative HPLC separation. The antimicrobial activity of voucapans and Pterodon oleoresin was determined against 8 Gram-positive strains, 11 Gram-negative strains and 4 Candida species by plaque microdilution assay. Cytotoxicity was evaluated in HaCaT cells by the colorimetric method of MTT - [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]]. The anti-inflammatory potential was determined by the following evaluations: phospholipase A2 inhibitory activity by fluorimetric method, expression of COX-2 and NRF2 and quantification of inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 by flow cytometry. Samples were tested at concentrations which maintained 90% viability (CV90) of HaCaT cells, in order to avoid the use of cytotoxic concentrations in anti-inflammatory assays. Three compounds were identified via NMR: 6α, 19β-diacetoxy-7β, 14β-dihydroxyivouacapane (V1), 6α-acetoxy-7β, 14β-dihydroxyivouacapane (V2) and methyl α-acetoxy-7β-hydroxyivacapan-17β-oate (V3). All three vouacapans and oleoresin were more active against Gram-positive strains. Regarding Gram-negative strains, the samples were only active against Pseudomonas aeruginosa. Vouacapane V2 showed the best antibacterial activity, proving to be active against 7 of the 8 Gram-positive bacteria evaluated, presenting values of minimum inhibitory concentration between 62.5 and 125 μg/mL. Samples had no inhibitory activity against the strains C. glabrata, C. kruzei, C. parapsilosis and C. albicans. The olororesin and V1, V2 and V3 had CV90 of 7.5 μg/mL, 19.0 μg/mL, 13.8 μg/mL and 4.00 μg/mL, respectively, against HaCaT cells. The Pterodon oleoresin and the V2 and V3 vouacapans inhibited phospholipase A2 activity by 30.78%, 24.96% and 77.64%, respectively. V2 and V3 vouacapans at CV90 inhibited COX-2 expression in 28.3% and 33.17%, respectively. Sucupira oleoresin was able to inhibit IL-6 production by 35.47%. The expression of NRF2 and the production of IL-8 were not altered by the substances tested, in comparison to the control. Results support the popular use of sucupira fruits as antibacterial and anti-inflammatory and show that these activities may be associated with the presence of vouacapans.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/32585 |
| Date | 22 February 2018 |
| Creators | Oliveira, Leandra de Almeida Ribeiro |
| Contributors | Bara, Maria Teresa Freitas, Silveira, Dâmaris |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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