Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O CD3 como alvo terapêutico de anticorpos, pode induzir a depleção parcial dos linfócitos T circulantes, provocando uma imunossupressão, que pode ser explorada clinicamente. Com isso, a busca por anticorpos anti-CD3 humanizados tem relevância biotecnológica. Entretanto, o CD3 é um antígeno de membrana de difícil preparação. Desse modo, procuramos obter um antígeno mimético ao CD3 que se ligue com alta afinidade a um anticorpo conhecidamente imunomodulador, o anticorpo monoclonal OKT3, de forma a facilitar a busca de novos anticorpos terapeuticos. Para isso utilizou-se o biopanning, por phage display, para selecionar peptídeos ligantes, a partir de uma biblioteca de peptídeos randômicos constrita de sete resíduos, PhDC7C (Biolabs). Um protocolo de seleção baseado em seleção negativa com IgG2a de camundongo, seguido de três ciclos sucessivos de seleção positiva. Para validação desses biopanning foi feita a titulação dos ciclos comparando-os a uma curva padrão, usando a biblioteca original amplificada por PCR, que foi utilizada para normalizar a quantidade de DNA. Foram obtidas sub-bibliotecas com um título em torno de 106 pfu/mL. Essas sub-bibliotecas foram analisadas por sequenciamento de DNA de alto desempenho e por bioinformática em busca de peptídeos selecionados especificamente pelo paratopo do anticorpo OKT3, um anti-CD3. Com a análise de bioinformática foi permitido à comparação das sequencias obtidas aos bancos de dados, existentes. Assim, foram excluídos, os peptídeos conhecidamente resultante de seleção inespecífica. Em conclusão, não foi possível encontrar um peptídeo ligante ao alvo de interesse. Provavelmente o viés encontrado na biblioteca, interferiu no sucesso da técnica, mas modificações no protocolo de seleção deverão ser considerados na seleção de peptídeos ligantes, que sirvam de mimotopos. / Anti-CD3 antibodies, a target for antibody therapy, may induce partial depletion of circulating T lymphocytes, causing immunosuppression, which can be explored clinically. Thus, a search for humanized anti-CD3 antibodies has a biotechnological relevance. However, CD3 is a difficult-to-prepare membrane antigen. Thus, we aim to obtain a CD3 antigen mimetic that binds with high affinity to a known immunomodulatory anti-CD3, the mouse monoclonal antibody OKT3. We use a seven-residue, phage display peptide library PhDC7C (Biolabs) to select for OKT3 mAb ligands peptides. The screening involves a negative selection with mouse IgG2a and three successive positive selection cycles. The validation of biopanning was done with PCR, which was used to quantify the amount of DNA. Sub-libraries with a titer of about 106 pfu / ml were obtained. These sub-libraries were analyzed by high-throughput DNA sequencing and by bioinformatics in search peptides selected specifically for the paratope of the OKT3 molecule. With a bioinformatics analysis it was possible to compare the sequences with the existing databases. Thus, peptides known as non-specific binding were excluded. However, a peptide binding to the target of interest could not be found. Further improvement in selection techinique may yield to specific OKT3 binding mimotopes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/33864 |
| Date | 03 August 2018 |
| Creators | Nunes, Ana Paula Costa Athayde |
| Contributors | Maranhão, Andréa Queiroz, Burtet, Rafael Trindade, Brígido, Marcelo de Macedo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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