Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-21T14:21:33Z
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2010_FlaviadaSilvaNaderMotta.pdf: 3843006 bytes, checksum: be72ce6d2ae5ec4a5cde40aa3a698258 (MD5) / A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização de alvos potenciais para a quimioterapia da doença de Chagas tendo as proteases como principal enfoque, uma vez que estão envolvidas em processos biológicos fundamentais para a viabilidade e virulência de patógenos. Neste contexto, essa tese aborda alguns aspectos estruturais e funcionais de serino-proteases pertencente à família Prolil Oligopeptidase: a oligopeptidase B (OPBTc) e prolil oligopeptidase (POPTc 80) de Trypanosoma cruzi e a prolil oligopeptidase (POP Tb) de Trypanosoma brucei. A OPBTc participa da invasão celular por meio do recrutamento e fusão de lisossomos da célula hospedeira até o local de ligação do parasito por uma via dependente de Ca2+. Por meio deste trabalho, a OPBTc tornou-se a primeira oligopeptidase B a ter sua estrutura dimérica confirmada por ultracentrifugação analítica. Experimentos de dicroísmo circular mostraram que em altas temperaturas, a enzima conserva sua estrutura secundária, mas não a terciária. A perda da estrutura terciária por tratamento térmico acompanha a diminuição da atividade da enzima e a perda da dimerização, que ocorrem a partir de 50 °C. No entanto, a associação do dímero é resistente a altas concentrações de sal e a tratamento com reagentes redutores, indicando que esta interação não ocorre devido a pontes dissulfeto intermoleculares. Este trabalho também mostra a caracterização funcional da POP de T. brucei, protozoário causador da doença do sono. Esta protease foi capaz de hidrolisar colágeno tipo I semi-purificado in vitro e colágeno nativo em mesentério de rato, além de peptídeos hormonais. Foi observado ainda, que POP Tb é liberada na corrente sanguínea de camundongos infectados pelo T. brucei, onde permanece ativa, sugerindo sua contribuição para a patogênese da doença do sono. Como já proposto em estudos prévios, a POP Tc80 está envolvida na entrada do T. cruzi em célula hospedeiras não fagocíticas e alguns de seus substratos naturais foram caracterizados mostrando que a mesmo hidrolisa colágenos do tipo I e IV e fibronectina. O mecanismo desta catálise não é completamente entendido, porém cálculos de interação entre o modelo estrutural teórico da POP Tc80 com o colágeno mostraram que ocorre uma abertura dos domínios da enzima para entrada do substrato. Para verificar essa hipótese, mutações sítios dirigidas na POP Tc80 acarretaram na perda da sua atividade devido à rigidez da enzima, impedindo o acesso do substrato à fenda catalítica. Finalmente, ainda na tentativa de esclarecer o papel da POP Tc80 na infecção do T. cruzi, foi montada uma estratégia para silenciar seu gene. Os resultados preliminares indicam que um alelo do gene poptc80 sofreu recombinação homóloga sendo trocado pelo marcador de seleção, o gene de resistência a neomicina. / The research activities of our group aim the identication and characterization of potential targets for chemotherapy oT Chagas:s disease, and proteases are the main focus since they are involved in biological processes essential for the viability and virulence of pathogens. In this context, this thesis addresses some structural and functional features of seine-proteases that belong to the Prolil Oligopeptidase family: the oligopeptidase B (OPBTc) and prolyl oligopeptidase (POP Tc80) of Trypanosoma cruzi and the prolyl oligopeptidase (POPTb) of Trypanosoma brucei. The OPBTc participates in cell invasion through the recruitment and fusion of the host cell lysosomes to the binding site of the parasite by a Ca2+ dependent pathway. In this work, the OPBTc had a structural approach, being the first oligopeptidase B to have its dimeric structure confirmed by analytical ultracentrifugation. Circular dichroism experiments showed that at high temperatures, the enzyme retains its secondary structure but not the tertiary. The loss of tertiary structure by heat treatment follows the decline of enzyme catalytic ability, which occurs from 50 "C. However, the association of the dimer is resistant to salt high concentration and treatment with reducing reagents, indicating that this interaction is not dueto intermolecular disulfide bonds. This work also shows the functional characterization of the enzyme POP of T. brucei {protozoan that causes sleeping sickness), the POPTb. This protease was able to hydrolyze native and semi-purified collagen type I and peptide hormones. In addition, POPTb is released into the bloodstream of T. brucei infected mice, where it remains active, suggesting their contribution to the pathogenesis of sleeping sickness. As shown in previous studies, the POP Tc80 is involved in the entry of the parasite in the non-phagocytic host cell and some of its natural substrates were characterized showing that the enzyme hydrolyzes collagen type I and IV and fibronectin. The mechanism of this catalysis is not completely understood, but docking analysis of the theoretical structural model of POP Tc80 with collagen, showed that the enzyme domains open to substrate entry. To investigate this hypothesis, site directed mutations in POP Tc80 resulted in loss of its activity due to the rigidity of the enzyme, preventing the substrate access to the catalytic pocket. In a attempt to clarify the role of POP Tc80 in T. cruzi infection, it was set up a strategy to silence its gene. Preliminary results indicate that one allele of the poptc80 gene has been replaced by the selection marquee, the gene for resistance to neomycin, through homologous recombination.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/9262 |
| Date | 09 April 2010 |
| Creators | Motta, Flávia da Silva Nader |
| Contributors | Bastos, Izabela Marques Dourado |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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