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Previous issue date: 2017-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os micro-organismos que habitam o continente Antártico podem apresentar produção de compostos de interesse industrial e ambiental com propriedades específicas por estarem adaptados às condições adversas da Antártica. Dentre os compostos produzidos por micro-organismos da Antártica podemos destacar as enzimas adaptadas ao frio. O presente trabalho teve como objetivo principal estudar a diversidade dos fungos filamentosos e leveduriformes isolados de cinco amostras de sedimentos marinhos da Antártica, bem como prospectar as enzimas lipase e protease. Para o isolamento dos fungos duas estratégias foram aplicadas (com e sem enriquecimento das amostras). Para ambas as estratégias, os sedimentos marinhos foram diluídos em solução salina e após homogeneização inoculados em placas de Petri contendo quatro diferentes meios de cultura (PDA, BSA, PDA diluído 10x, MA), as quais foram incubadas a 5 e 15ºC. Um total de 226 isolados foi recuperado, sendo 60 fungos filamentosos e 166 leveduras. A maioria dos fungos foi isolada a 15ºC (68%) De acordo com os dados de sequenciamento e análise filogenética, representantes de oito gêneros e quatro espécies de fungos filamentosos foram isolados das amostras de sedimentos marinhos. Os gêneros Penicillium e Pseudogymnoascus foram os mais abundantes (40,00%), seguidos pelo gênero Cadophora (6,67%), Cladosporium (5,00%), Toxicocladosporium, Pseudocercosporella, Pestalotiopsis e Paraconiothyrium (1,67%). Para as leveduras, representantes de nove gêneros e 13 espécies foram recuperadas das amostras, sendo a espécie Metschnikowia australis (45,18%) a mais abundante, seguida por representantes do gênero Mrakia (21,68%), Cryptococcus e Glaciozyma (7,83%), Meyerozyma e Holtermanniella (5,42%), Rhodotorula (4,21%), Cystobasidium (1,80%) e Phenoliferia (0,60%). Alguns dos fungos filamentosos identificados no presente trabalho não haviam sido ainda reportados em ambientes Antárticos (Toxicocladosporium, Pseudocercosporella e Paraconiothyrium). As análises de diversidade revelaram que a amostra A5 coletada no Refúgio 2 (20 m, 0,1ºC) apresentou a maior riqueza de espécies, enquanto a amostra A2 coletada no Botany Point (24,7 m, 0,6ºC) se mostrou mais diversa. Com relação à diversidade β, as amostras A5 e A6 coletadas na mesma região geográfica (Refúgio 2) apresentaram o maior compartilhamento de espécies (42,3%). Os isolados foram avaliados quando à capacidade de produção de lipase e protease. Os resultados revelaram que a levedura 6A-1C2II (M. australis) apresentou a maior atividade lipolítica (0,88 U.mL-1) e o fungo filamentoso 4A-1C615III (Pseudogymnoascus sp.) a maior atividade proteolítica (6,21 U.mL-1). Ambos os isolados foram submetidos aos estudos de avaliação de diferentes fatores na produção das enzimas visando maximização da produção enzimática. Após a condução de planejamentos experimentais do tipo Plackett-Burman (PB), a produção de lipase por M. australis 6A-1C2II aumentou 1,36 vezes e a produção de protease por Pseudogymnoascus sp. 4A-1C615III 4,72 vezes. Nos experimentos de validação das condições otimizadas, as médias das triplicatas apresentaram valores inferiores aos alcançados nos planejamentos. A condução do presente trabalho permitiu a ampliação do conhecimento sobre a diversidade de fungos e leveduras que habitam os sedimentos marinhos da Antártica. Em adição, resultou na obtenção de isolados de fungos filamentosos e leveduras de ambiente extremo, os quais estão sendo mantidos na coleção de pesquisa associada à Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRMUNESP) e poderão ser utilizados em estudos futuros de prospecção e aplicação biotecnológica. / Microorganisms that inhabit the Antarctic continent can produce compounds of industrial and environmental interest with specific characteristics, since they are adapted to the adverse conditions in Antarctica. Among the compounds that are produce by Antarctic microorganisms we can enhance the cold-adapted enzymes. The main objective of this research was to study the diversity of filamentous fungi and yeasts from five Antarctic marine sediments samples, as well as to prospect lipase and protease enzymes. Two strategies were applied for fungal isolation (with and without enrichment of the samples). For both strategies, the sediments were diluted with saline solution and after homogenization the dilutions were inoculated in Petri dishes containing four different culture media (PDA, BSA, PDA diluted 10x, and MA), which were incubated at 5 and 15 ºC. The total amount of isolates recovered was 226, being 60 fungi and 166 yeasts. Most of the fungi were isolated at 15ºC (68%). According to sequencing data and phylogenetic analyses, eight genera and four species of filamentous fungi were isolated from the marine sediment samples. The genera Penicillium and Pseudogymnoascus were the most abundant (40.00%); followed by genus Cadophora (6.67%), Cladosporium (5.00%), Toxicocladosporium, Pseudocercosporella, Pestalotiopsis, and Paraconiothyrium (1.67%). Representatives of nine genera and thirteen yeast species were recovered from the sediment samples, the specie Metschnikowia australis was the most abundant (45.18%), followed by isolates from genus Mrakia (21.68%), Cryptococcus and Glaciozyma (7.83%), Meyerozyma and Holtermanniella (5.42%), Rhodotorula (4.21%), Cystobasidium (1.80%), and Phenoliferia (0.60%). Some of the fungi identified in the present work were not reported in Antarctic environments before (Toxicocladosporium, Pseudocercosporella e Paraconiothyrium). The diversity analyses showed that the sample A5 collected from Refúgio 2 (20 m, 0.1ºC) presented higher species richness, while sample A2 that was collect from Botany Point (24,7 m, 0.6ºC) was the most diverse. According to β diversity data, the samples A5 and A6 that were collect in the same geographic region (Refúgio 2) showed the higher species sharing (42.3%). The capacity to produce lipase and protease were evaluated. The results revealed that the yeast 6A-1C2II (M. australis) presented the best lipolytic activity (0.88 U.mL-1) and the fungus 4A- 1C615III (Pseudogymnoascus sp.) the best proteolytic activity (6.21 U.mL-1). Both isolates were submitted to the evaluation of different factors in the enzyme production process aiming the enzymatic production maximization. After the conduction of Plackett-Bruman (PB) experimental designs, the lipase production by M. australis 6A- 1C2II increased 1.36 times and the protease production by Pseudogymnoascus sp. 4A- 1C615III increased 4.72 times. In the optimized conditions validation experiments, results from the triplicates averages were lower than that one reached during the experimental designs. This work allowed the improvement in the knowledge of fungal diversity in the Antarctic marine sediments ecosystem. In addition, resulted in the obtaining of fungi and yeasts from extreme environment, which are being maintained in the research culture collection associated to the Central of Microbial Resources (CRMUNESP) and can be used in future studies related to prospection and biotechnology application. / FAPESP: 2013/19486-0
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unesp.br:11449/149887 |
| Date | 22 February 2017 |
| Creators | Inforsato, Fábio José [UNESP] |
| Contributors | Universidade Estadual Paulista (UNESP), Sette, Lara Durães [UNESP], Rodrigues, André [UNESP] |
| Publisher | Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNESP, instname:Universidade Estadual Paulista, instacron:UNESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 600 |
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