Submitted by FÁBIO JOSÉ INFORSATO null (fabio.j.i@outlook.com.br) on 2017-03-16T13:47:27Z No. of bitstreams: 1 dissertação_final.pdf: 2007541 bytes, checksum: de230e02fdf0f3c59b1fb54da819cd1d (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido não contém o certificado de aprovação. O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija estas informações e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-03-21T17:20:08Z (GMT) / Submitted by FÁBIO JOSÉ INFORSATO null (fabio.j.i@outlook.com.br) on 2017-03-22T01:58:27Z No. of bitstreams: 1 dissertação.pdf: 2106040 bytes, checksum: 5384cac1311ff16eee3bec56a6987c15 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-22T20:27:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 inforsato_fj_me_rcla.pdf: 2106040 bytes, checksum: 5384cac1311ff16eee3bec56a6987c15 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T20:27:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 inforsato_fj_me_rcla.pdf: 2106040 bytes, checksum: 5384cac1311ff16eee3bec56a6987c15 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os micro-organismos que habitam o continente Antártico podem apresentar produção de compostos de interesse industrial e ambiental com propriedades específicas por estarem adaptados às condições adversas da Antártica. Dentre os compostos produzidos por micro-organismos da Antártica podemos destacar as enzimas adaptadas ao frio. O presente trabalho teve como objetivo principal estudar a diversidade dos fungos filamentosos e leveduriformes isolados de cinco amostras de sedimentos marinhos da Antártica, bem como prospectar as enzimas lipase e protease. Para o isolamento dos fungos duas estratégias foram aplicadas (com e sem enriquecimento das amostras). Para ambas as estratégias, os sedimentos marinhos foram diluídos em solução salina e após homogeneização inoculados em placas de Petri contendo quatro diferentes meios de cultura (PDA, BSA, PDA diluído 10x, MA), as quais foram incubadas a 5 e 15ºC. Um total de 226 isolados foi recuperado, sendo 60 fungos filamentosos e 166 leveduras. A maioria dos fungos foi isolada a 15ºC (68%) De acordo com os dados de sequenciamento e análise filogenética, representantes de oito gêneros e quatro espécies de fungos filamentosos foram isolados das amostras de sedimentos marinhos. Os gêneros Penicillium e Pseudogymnoascus foram os mais abundantes (40,00%), seguidos pelo gênero Cadophora (6,67%), Cladosporium (5,00%), Toxicocladosporium, Pseudocercosporella, Pestalotiopsis e Paraconiothyrium (1,67%). Para as leveduras, representantes de nove gêneros e 13 espécies foram recuperadas das amostras, sendo a espécie Metschnikowia australis (45,18%) a mais abundante, seguida por representantes do gênero Mrakia (21,68%), Cryptococcus e Glaciozyma (7,83%), Meyerozyma e Holtermanniella (5,42%), Rhodotorula (4,21%), Cystobasidium (1,80%) e Phenoliferia (0,60%). Alguns dos fungos filamentosos identificados no presente trabalho não haviam sido ainda reportados em ambientes Antárticos (Toxicocladosporium, Pseudocercosporella e Paraconiothyrium). As análises de diversidade revelaram que a amostra A5 coletada no Refúgio 2 (20 m, 0,1ºC) apresentou a maior riqueza de espécies, enquanto a amostra A2 coletada no Botany Point (24,7 m, 0,6ºC) se mostrou mais diversa. Com relação à diversidade β, as amostras A5 e A6 coletadas na mesma região geográfica (Refúgio 2) apresentaram o maior compartilhamento de espécies (42,3%). Os isolados foram avaliados quando à capacidade de produção de lipase e protease. Os resultados revelaram que a levedura 6A-1C2II (M. australis) apresentou a maior atividade lipolítica (0,88 U.mL-1) e o fungo filamentoso 4A-1C615III (Pseudogymnoascus sp.) a maior atividade proteolítica (6,21 U.mL-1). Ambos os isolados foram submetidos aos estudos de avaliação de diferentes fatores na produção das enzimas visando maximização da produção enzimática. Após a condução de planejamentos experimentais do tipo Plackett-Burman (PB), a produção de lipase por M. australis 6A-1C2II aumentou 1,36 vezes e a produção de protease por Pseudogymnoascus sp. 4A-1C615III 4,72 vezes. Nos experimentos de validação das condições otimizadas, as médias das triplicatas apresentaram valores inferiores aos alcançados nos planejamentos. A condução do presente trabalho permitiu a ampliação do conhecimento sobre a diversidade de fungos e leveduras que habitam os sedimentos marinhos da Antártica. Em adição, resultou na obtenção de isolados de fungos filamentosos e leveduras de ambiente extremo, os quais estão sendo mantidos na coleção de pesquisa associada à Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRMUNESP) e poderão ser utilizados em estudos futuros de prospecção e aplicação biotecnológica. / Microorganisms that inhabit the Antarctic continent can produce compounds of industrial and environmental interest with specific characteristics, since they are adapted to the adverse conditions in Antarctica. Among the compounds that are produce by Antarctic microorganisms we can enhance the cold-adapted enzymes. The main objective of this research was to study the diversity of filamentous fungi and yeasts from five Antarctic marine sediments samples, as well as to prospect lipase and protease enzymes. Two strategies were applied for fungal isolation (with and without enrichment of the samples). For both strategies, the sediments were diluted with saline solution and after homogenization the dilutions were inoculated in Petri dishes containing four different culture media (PDA, BSA, PDA diluted 10x, and MA), which were incubated at 5 and 15 ºC. The total amount of isolates recovered was 226, being 60 fungi and 166 yeasts. Most of the fungi were isolated at 15ºC (68%). According to sequencing data and phylogenetic analyses, eight genera and four species of filamentous fungi were isolated from the marine sediment samples. The genera Penicillium and Pseudogymnoascus were the most abundant (40.00%); followed by genus Cadophora (6.67%), Cladosporium (5.00%), Toxicocladosporium, Pseudocercosporella, Pestalotiopsis, and Paraconiothyrium (1.67%). Representatives of nine genera and thirteen yeast species were recovered from the sediment samples, the specie Metschnikowia australis was the most abundant (45.18%), followed by isolates from genus Mrakia (21.68%), Cryptococcus and Glaciozyma (7.83%), Meyerozyma and Holtermanniella (5.42%), Rhodotorula (4.21%), Cystobasidium (1.80%), and Phenoliferia (0.60%). Some of the fungi identified in the present work were not reported in Antarctic environments before (Toxicocladosporium, Pseudocercosporella e Paraconiothyrium). The diversity analyses showed that the sample A5 collected from Refúgio 2 (20 m, 0.1ºC) presented higher species richness, while sample A2 that was collect from Botany Point (24,7 m, 0.6ºC) was the most diverse. According to β diversity data, the samples A5 and A6 that were collect in the same geographic region (Refúgio 2) showed the higher species sharing (42.3%). The capacity to produce lipase and protease were evaluated. The results revealed that the yeast 6A-1C2II (M. australis) presented the best lipolytic activity (0.88 U.mL-1) and the fungus 4A- 1C615III (Pseudogymnoascus sp.) the best proteolytic activity (6.21 U.mL-1). Both isolates were submitted to the evaluation of different factors in the enzyme production process aiming the enzymatic production maximization. After the conduction of Plackett-Bruman (PB) experimental designs, the lipase production by M. australis 6A- 1C2II increased 1.36 times and the protease production by Pseudogymnoascus sp. 4A- 1C615III increased 4.72 times. In the optimized conditions validation experiments, results from the triplicates averages were lower than that one reached during the experimental designs. This work allowed the improvement in the knowledge of fungal diversity in the Antarctic marine sediments ecosystem. In addition, resulted in the obtaining of fungi and yeasts from extreme environment, which are being maintained in the research culture collection associated to the Central of Microbial Resources (CRMUNESP) and can be used in future studies related to prospection and biotechnology application. / FAPESP: 2013/19486-0

The growing demand for strawberries has imposed challenges, especially regarding the control of pests. Many farmers report problems with reduced chemical control efficiency, probably due to selection of resistant populations of insects and mites. An alternative is the use of biological control using pathogenic fungi as a tool in integrated pest management. Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) are generalist entomopathogenic fungi with worldwide distribution and can cause diseases in a large number of hosts. Many studies on the development of Metarhizium as a biological control agent were performed, but this bulk of knowledge is in remarkable contrast to the lack of research on the fundamental ecology of Metarhizium in agroecosystems. This thesis aimed to evaluate the establishment, persistence and dispersal of these entomopathogenic fungi in strawberry crop soil in Inconfidentes, Minas Gerais, Brazil; and to study the diversity and abundance of species of Metarhizium isolated from organic and conventional strawberry crop soils, and the field margins in Brazil and Denmark. The effectiveness of new species of Metarhizium recently found in Brazil, was evaluated against two spotted spider mite, Tetranychus urticae. Applied isolates of M. anisopliae (ESALQ1037) and M. robertsii (ESALQ1426) were able to persist for up to 12 months after the application within the soil, and disperse to other plots and colonize the rhizosphere of strawberry plants. In the plots where ESALQ1037 and ESALQ1426 were applied, 25% and 87.5% of the isolates recovered after 12 months consisted of the same isolates inoculated. A new taxonomically unassigned lineage, referred to as Metarhizium sp. Indet. 5 in this study, was found in strawberry crop margins. The dominant species of Metarhizium in Brazil and Denmark was Metarhizium robertsii and M. brunneum respectively. Further, Metarhizium pemphigi was first detected in Denmark in this study. Soil in organically grown strawberries harbored a more diverse population of Metarhizium spp. compared with conventionally grown strawberries. These studies showed for the first time the potential of new species of Metarhizium as spider mite biological control agents, the lowest median lethal time (LT50 = 4 ± 0.17 days) was observed in mites treated with the isolate ESALQ1638 of Metarhizium sp. indet. 1. The best isolates were ESALQPL63 of B. bassiana, ESALQ1608 and ESALQ1638 of Metarhizium sp. indet. 1 and ESALQ3069 and ESALQ3222 of M. pingshaense based on the survival curve, total mortality, percentage of sporulated cadavers and LT50. Knowledge of the diversity of Metarhizium spp. and persistence in strawberry soil generated in this study may be useful in developing conservation strategies and maximize the natural biological pest control. / A crescente demanda por morangos vem impondo desafios, especialmente quanto ao controle das pragas. Muitos agricultores relatam problemas com a redução da eficiência do controle químico, provavelmente devido à seleção de populações resistentes de insetos e ácaros. Uma alternativa é o uso de controle biológico com fungos entomopatogênicos como ferramenta dentro do manejo integrado de pragas. Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae), são fungos entomopatogênicos generalistas com distribuição cosmopolita e que podem causar doenças em um grande número de hospedeiros. Muitos estudos sobre o desenvolvimento de Metarhizium como agente de controle biológico foram realizados, mas este leque de conhecimento está em contraste com a notável falta de investigação sobre a ecologia de Metarhizium nos agroecossistemas. Esta tese teve como objetivo avaliar o estabelecimento, persistência e dispersão destes fungos entomopatogênicos em solo de morangueiro em Inconfidentes, Minas Gerais, Brasil; bem como estudar a diversidade e abundância de espécies de Metarhizium isolados do solo de cultivos orgânico e convencional de morangueiro, e das margens das plantações no Brasil e Dinamarca. A eficácia de novas espécies de Metarhizium, encontradas recentemente no Brasil, foi avaliada contra o ácaro rajado, Tetranychus urticae. Os isolados inoculados de M. anisopliae (ESALQ1037) e M. robertsii (ESALQ1426) foram capazes de persistir por até 12 meses após a aplicação no solo, além de dispersar para outras parcelas e colonizar a rizosfera dos morangueiros. Nas parcelas onde ESALQ1037 e ESALQ1426 foram aplicados, 25% e 87,5% dos isolados recuperados após 12 meses consistiam dos mesmos isolados inoculados. Uma nova linhagem não taxonomicamente identificada, referida neste trabalho como Metarhizium sp. Indet. 5, foi encontrada nas margens de morangueiros cultivados. A espécie dominante de Metarhizium no Brasil e Dinamarca foi Metarhizium robertsii e M. brunneum, respectivamente. Além disso, Metarhizium pemphigi foi detectado pela primeira vez na Dinamarca neste estudo. Solos de cultivo orgânico de morangueiro em geral apresentaram uma diversidade maior de Metarhizium do que solos de cultivos convencionais. Estes estudos revelaram pela primeira vez o potencial de novas espécies de Metarhizium como agentes de controle biológico do ácaro rajado, sendo o menor tempo letal mediano (TL50= 4 ± 0.17 dias) observado em ácaros tratados com o isolado ESALQ1638 de Metarhizium sp. indet. 1. Os melhores isolados foram ESALQPL63 de B. bassiana, ESALQ1608 e ESALQ1638 de Metarhizium sp. indet. 1 e ESALQ3069 e ESALQ3222 de M. pingshaense baseado na curva de sobrevivência, mortalidade total, porcentagem de cadáveres esporulados e TL50. O conhecimento da diversidade de Metarhizium spp. e persistência em solos de morango, gerados neste estudo, poderão ser úteis no desenvolvimento de estratégias de conservação e maximizar o controle biológico natural de pragas.

The growing demand for strawberries has imposed challenges, especially regarding the control of pests. Many farmers report problems with reduced chemical control efficiency, probably due to selection of resistant populations of insects and mites. An alternative is the use of biological control using pathogenic fungi as a tool in integrated pest management. Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) are generalist entomopathogenic fungi with worldwide distribution and can cause diseases in a large number of hosts. Many studies on the development of Metarhizium as a biological control agent were performed, but this bulk of knowledge is in remarkable contrast to the lack of research on the fundamental ecology of Metarhizium in agroecosystems. This thesis aimed to evaluate the establishment, persistence and dispersal of these entomopathogenic fungi in strawberry crop soil in Inconfidentes, Minas Gerais, Brazil; and to study the diversity and abundance of species of Metarhizium isolated from organic and conventional strawberry crop soils, and the field margins in Brazil and Denmark. The effectiveness of new species of Metarhizium recently found in Brazil, was evaluated against two spotted spider mite, Tetranychus urticae. Applied isolates of M. anisopliae (ESALQ1037) and M. robertsii (ESALQ1426) were able to persist for up to 12 months after the application within the soil, and disperse to other plots and colonize the rhizosphere of strawberry plants. In the plots where ESALQ1037 and ESALQ1426 were applied, 25% and 87.5% of the isolates recovered after 12 months consisted of the same isolates inoculated. A new taxonomically unassigned lineage, referred to as Metarhizium sp. Indet. 5 in this study, was found in strawberry crop margins. The dominant species of Metarhizium in Brazil and Denmark was Metarhizium robertsii and M. brunneum respectively. Further, Metarhizium pemphigi was first detected in Denmark in this study. Soil in organically grown strawberries harbored a more diverse population of Metarhizium spp. compared with conventionally grown strawberries. These studies showed for the first time the potential of new species of Metarhizium as spider mite biological control agents, the lowest median lethal time (LT50 = 4 ± 0.17 days) was observed in mites treated with the isolate ESALQ1638 of Metarhizium sp. indet. 1. The best isolates were ESALQPL63 of B. bassiana, ESALQ1608 and ESALQ1638 of Metarhizium sp. indet. 1 and ESALQ3069 and ESALQ3222 of M. pingshaense based on the survival curve, total mortality, percentage of sporulated cadavers and LT50. Knowledge of the diversity of Metarhizium spp. and persistence in strawberry soil generated in this study may be useful in developing conservation strategies and maximize the natural biological pest control. / A crescente demanda por morangos vem impondo desafios, especialmente quanto ao controle das pragas. Muitos agricultores relatam problemas com a redução da eficiência do controle químico, provavelmente devido à seleção de populações resistentes de insetos e ácaros. Uma alternativa é o uso de controle biológico com fungos entomopatogênicos como ferramenta dentro do manejo integrado de pragas. Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae), são fungos entomopatogênicos generalistas com distribuição cosmopolita e que podem causar doenças em um grande número de hospedeiros. Muitos estudos sobre o desenvolvimento de Metarhizium como agente de controle biológico foram realizados, mas este leque de conhecimento está em contraste com a notável falta de investigação sobre a ecologia de Metarhizium nos agroecossistemas. Esta tese teve como objetivo avaliar o estabelecimento, persistência e dispersão destes fungos entomopatogênicos em solo de morangueiro em Inconfidentes, Minas Gerais, Brasil; bem como estudar a diversidade e abundância de espécies de Metarhizium isolados do solo de cultivos orgânico e convencional de morangueiro, e das margens das plantações no Brasil e Dinamarca. A eficácia de novas espécies de Metarhizium, encontradas recentemente no Brasil, foi avaliada contra o ácaro rajado, Tetranychus urticae. Os isolados inoculados de M. anisopliae (ESALQ1037) e M. robertsii (ESALQ1426) foram capazes de persistir por até 12 meses após a aplicação no solo, além de dispersar para outras parcelas e colonizar a rizosfera dos morangueiros. Nas parcelas onde ESALQ1037 e ESALQ1426 foram aplicados, 25% e 87,5% dos isolados recuperados após 12 meses consistiam dos mesmos isolados inoculados. Uma nova linhagem não taxonomicamente identificada, referida neste trabalho como Metarhizium sp. Indet. 5, foi encontrada nas margens de morangueiros cultivados. A espécie dominante de Metarhizium no Brasil e Dinamarca foi Metarhizium robertsii e M. brunneum, respectivamente. Além disso, Metarhizium pemphigi foi detectado pela primeira vez na Dinamarca neste estudo. Solos de cultivo orgânico de morangueiro em geral apresentaram uma diversidade maior de Metarhizium do que solos de cultivos convencionais. Estes estudos revelaram pela primeira vez o potencial de novas espécies de Metarhizium como agentes de controle biológico do ácaro rajado, sendo o menor tempo letal mediano (TL50= 4 ± 0.17 dias) observado em ácaros tratados com o isolado ESALQ1638 de Metarhizium sp. indet. 1. Os melhores isolados foram ESALQPL63 de B. bassiana, ESALQ1608 e ESALQ1638 de Metarhizium sp. indet. 1 e ESALQ3069 e ESALQ3222 de M. pingshaense baseado na curva de sobrevivência, mortalidade total, porcentagem de cadáveres esporulados e TL50. O conhecimento da diversidade de Metarhizium spp. e persistência em solos de morango, gerados neste estudo, poderão ser úteis no desenvolvimento de estratégias de conservação e maximizar o controle biológico natural de pragas.