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Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O sorogrupo O26 de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) atípica é um dos sorogrupos mais frequentes implicados na diarréia infantil, sendo um sorogrupo muito comum também em amostras de E. coli enterohemorrágica (EHEC). O sorotipo mais frequente dentro do sorogrupo O26 tanto em amostras de EPEC quanto em amostras de EHEC é a O26:H11.
Num recente estudo, amostras de EPEC atípica O26:H11 isoladas de crianças com diarréia apresentaram um padrão de adesão localizado (AL), porém eram desprovidas da fímbria BFP responsável pelo fenótipo AL das EPEC típicas. Uma dessas amostras, E. coli 22, foi escolhida para caracterização de seus determinantes genéticos. Foi construída uma biblioteca genômica da amostra 22 na E. coli DH5α e identificado um clone cosmídeo denominado pV-B-6, aderente a células HeLa. O clone pV-B-6 exibiu um padrão de adesão difusa (AD) sobre as células epiteliais, diferente da formação de microcolônias presentes na adesão AL apresentada pela amostra 22. O cosmídio pV-B-6 foi submetido a mutagênese utilizando o transposon mini-Tn10::kan e identificado um mutante não aderente (pV-B-6-Tn). Um fragmento de 2,3 kb EcoRI-HindIII contendo 1 kb do mini-Tn10 foi clonado, sendo identificado um gene, ldaH, que possuía 73% de identidade com a subunidade fimbrial faeH da de fímbria K88 ETEC. Essa região foi denominada de “locus for diffuse adherence” (lda). O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a adesina codificada pelo locus lda, a qual é responsável por conferir o padrão AD a células HEp-2 na amostra pV-B-6. A análise em SDS-PAGE de extratos parcialmente purificados das amostras 22 e pV-B-6 mostrou uma banda protéica de aproximadamente 25 kDa, que estava ausente nos extratos do mutante pV-B-6-Tn. A proteína de 25 kDa foi cortada do gel, sendo determinado o sequenciamento da região amino-terminal. A sequência de aminoácidos correspondeu ‡ forma madura de LdaG, a principal subunidade estrutural da adesina. A expressão de Lda foi induzida em meio ágar MacConkey a 37o C. Para demonstrar que a adesina LDA era a responsável pelo padrão AD a células HEp-2, foi produzido um anti-soro LdaG em coelho. A especificidade do soro anti-LdaG foi determinada pela reação de “Imuno blot”. Apenas a proteína de 25 kDa foi reconhecida pelo soro imune, apresentando uma reação fortemente positiva com a amostra selvagem E. coli 22 e com o clone pV-B-6. Nenhuma reação do soro anti-LdaG foi observada no mutante, demonstrando, assim, a especificidade desse soro. Ensaios de inibição de adesão revelaram que o anti-soro LdaG reconheceu os epítopos da adesina responsáveis pela fenótipo AD, visto que foi capaz de inibir totalmente a adesão do clone pV-B-6. A imunomarcação com o anti-soro LdaG identificou na amostra 22 uma matriz de superfície amorfa sem nenhuma aparência de estrutura fimbrial. Quando observado em aumento maior, verificou-se a presença de estruturas fibrilares muito finas formando estruturas semelhantes a uma malha. Em contrapartida, nenhuma marcação foi observada no mutante LDA1. Foi determinada a incidência do gene ldaH em 65 amostras de EPEC atípica, isoladas em diferentes cidades brasileiras de crianças com diarreia aguda e de controles e pertencentes a 34 diferentes sorogrupos. Nenhuma dessas 65 amostras produtoras do padrão ALL em ensaios de 6 horas apresentou a sequência ldaH. Também foram estudadas 13 amostras de EPEC atípica que pertenciam aos sorogrupos O26, O55 e O111. O gene ldaH foi encontrado em quatro amostras, todas do sorogrupo O26 e que apresentavam o padrão AL em ensaios de três horas. No entanto, tanto os experimentos de PCR para amplificação do gene estrutural ldaG, como os experimentos de “Imuno blot” utilizando o anti-soro LdaG não revelaram a proteína de 25 KDa. Ensaios de inibição de adesão e imunofluorescência com soro antiK88 foram realizados com o intuito de investigar a relação antigênica entre as adesinas LDA e K88. Os resultados mostraram que ambas as adesinas são antigenicamente distintas, uma vez, que o soro anti-K88 não inibiu a AD e nem reconheceu qualquer estrutura presente na superfície da amostra pV-B-6. Neste estudo foi avaliado o papel da adesina LDA na virulência bacteriana, utilizando o modelo do camundongo tratado com estreptomicina e comparando a amostra selvagem 22 com a isogênica apresentando deleção do gene ldaG. Os resultados obtidos mostraram que aparentemente, a adesina LDA est· envolvida no processo de colonização, uma vez que a amostra selvagem 22 aderiu e colonizou mais eficientemente o ceco de camundongos C57BL/6J do que a amostra 22 ∆ldaG Concluindo, nossos resultados levaram a identificação e caracterização da adesina LDA responsável pela aderência difusa a células HEp-2. LDA È uma adesina afimbrial que contém uma subunidade principal, LdaG, cuja expressão é induzida em ágar MacConkey a 37o C. Estudos futuros são necessários para caracterizar melhor o papel da adesina LDA na virulência bacteriana. / The O26 serogroup of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is one
of the most frequently implicated in infant diarrhea and is also common among
enterohemorrhagic E. coli (EHEC) strains. The most common O26 strains
belong to EPEC/EHEC serotype O26:H11.
In a previous report, atypical EPEC strains O26:H11 isolated from
children with diarrhea exhibited a localized adherence (LA) pattern within 3
hours, but do not harbor the BFP fimbriae correlated with the LA phenotype of
typical EPEC. One isolate, E. coli 22 was used to characterize its genetic
determinants.
A genomic cosmid library of E. coli 22 was generated in E. coli K12 and
the resulting clones were screened for LA adherence to HEp-2 cells. One
cosmid clone, pV-B-6, exhibited adherence in a diffuse pattern over the entire
epithelial cell rather than the LA microcolony formation seen with E. coli 22.
Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pV-B-6
responsible for the adhesive phenotype. One isolate tested negative for
adherence (pV-B-6-Tn) was chosen for further analysis. DNA sequencing of a
subclone of pV-B-6 revealed an open reading frame, ldaH, whose predicted
protein product shares 73% amino acid identity with that of the E. coli K88
fimbrial gene faeH. This region was named the locus for diffuse adherence
(lda).
The aim of this study was to characterize the adhesin encoded by the
lda locus that is responsible for mediating diffuse adherence to HEp-2 cells.
SDS-PAGE of whole-cell cell lysates from E. coli 22 and pV-B-6
showed a broad band with an apparent molecular mass of 25 kDa, which was
absent in the pV-B-6-Tn extracts. The 25-KDa band was excised from the gel,
and its N-terminal amino acid sequence determined. The sequence
corresponds to the mature form of LdaG, the major structural subunit. The
expression of LdaG is induced on MacConkey agar at 37o
C.
To provide further evidence that the LDA adhesin was responsible for
the diffuse adherence seen on HEp-2 cells, we raised polyclonal rabbit
antiserum against the major structural subunit LdaG. Imuno blot analysis
17
showed that the antiserum recognized the 25-kDa band present in wildtype
E. coli 22 and pV-B-6, but not the pV-B-6-Tn mutant. Treatment of pV-B-
6 with the antiserum completed inhibited diffuse adherence of pV-B-6 to the
HEp-2 cells.
Immunogold labeling with LdaG antiserum identified an amorphous
surface matrix with no obvious fimbrial structure. At higher magnification, very
fine wiry fibrils forming mesh-like structures could be visualized.
To determine whether the lda locus was specific to our O26:H11 strain
or if it is present in other E. coli strains, we performed colony blots and HEp-2
adherence on a collection of 65 atypical EPEC strains representing 34 O
serogroups. Most (61.5%) of strains were positive for HEp-2 localized-like
adherence assay and all strains were ldaH probe negative. We also tested 13
atypical EPEC strains, which belonged to Dr. Luiz R. Trabulsi and ldaH was
found in four O26 LA positive strains. These strains were tested with an ldaG
gene probe, but were negative.
By using a K88 antiserum, it was possible to demonstrate different
antigenic determinants, between LDA and K88 adhesins.
A streptomycin-treated mouse model was used to compare the
intestinal colonization capacity of E. coli 22 strain with that of its ∆ldaG
derivative (LDA1). The results showed that E. coli 22 adheres and colonizes
the cecum of C57BL/6J mice more efficiently than the LDA1.
In conclusion, we were able to characterize the LDA adhesin
responsible for diffuse adherence to HEp-2 cells. LDA is an afimbrial adhesin
that contains a major subunit, LdaG, whose expression is induced on
MacConkey agar at 37o
C. Additional work is needed to characterize the role in
virulence of the LDA adhesin. / FAPESP: 01/03525-1 / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/21218 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Dulguer, Michelle Vanzella [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Scaletsky, Isabel Cristina Affonso [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 117 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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