O status oxidativo do espermatozoide atua sobre ele de diferentes formas, desde a capacitação até a fecundação do oócito. No entanto, as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser benéficas ou prejudiciais dependendo do contexto celular. Tendo em vista a baixa proteção antioxidante do sêmen criopreservado, associado às sucessivas manipulações que antecedem a fecundação in vitro, entender como esta célula se comporta em um ambiente oxidante e os impactos deste sobre o embrião é de suma importância. Com isto, o objetivo deste trabalho foi propor um modelo dose-dependente para o estudo do estresse oxidativo sobre o espermatozoide e possível impacto no desenvolvimento embrionário. Para isto, no experimento 1, palhetas de sêmen criopreservado de touros (n=5) da raça Nelore foram submetidas à incubação por 1 hora a 38,5 ºC e 5% CO2, com doses crescentes de peróxido de hidrogênio (0; 12,5; 25; e 50 µM). Ao final da incubação, os parâmetros de motilidade foram avaliados pelo sistema Computer Assisted System Analysis (CASA). No experimento 2, foram escolhidas duas doses de peróxido de hidrogênio com base nos resultados do experimento 1: alta (50 µM), baixa (12,5 µM) e também um controle (0 µM). Os espermatozoides foram incubados com as respectivas doses de peróxido de hidrogênio por 1 hora, e ao final da incubação foram utilizados para a fecundação in vitro (D=0). Neste experimento, além das análises do CASA, foram feitas avaliações do status oxidativo (CellROX® green e 2'-7'diacetato de diclorofluoresceína - DCFH), do potencial mitocondrial (JC-1), da cromatina (LA) e da capacitação espermática (clortetraciclina). Os embriões foram avaliados com relação à taxa de clivagem rápida (30 horas pós-inseminação), taxa de clivagem (D=3), taxa de desenvolvimento (D=5) e taxa de blastocisto (D=8). Para análise estatística foi utilizado o modelo de regressão polinomial, considerando p≤0,05. Tanto no experimento 1 quanto no experimento 2 houve detrimento dose-dependente do peróxido de hidrogênio sobre o padrão de movimento e de porcentagem de células móveis. Houve aumento dose-dependente da porcentagem de células positivas para CellROX® células capacitadas e positivas para o LA. Com relação às taxas de clivagem e de blastocisto, houve diminuição da porcentagem de embriões clivados e de blastocistos, conforme a dose de peróxido de hidrogênio foi aumentada. Referente à taxa de desenvolvimento embrionário, houve bloqueio das estruturas em 2-4 células. Nestas condições, o espermatozoide quando exposto a um ambiente oxidante, apresenta alterações no padrão de motilidade, no status oxidativo e na capacitação, sendo que estas interferem de forma negativa no desenvolvimento embrionário, desde o início da clivagem até a formação do blastocisto. / Oxidative status may influence spermatozoa by distinct mechanisms, from capacitation to oocyte fertilization. However, reactive oxygen species (ROS) could be beneficial or harmful depending on cellular context. Due to the low levels of antioxidant enzymes of cryopreserved semen, associated to successive manipulations prior to in vitro fertilization (IVF), it is momentous to understand the mechanism involved on sperm status in such conditions and the further impact on embryo development. The present study aimed to assess the possible impact of a dose-dependent model for sperm oxidative stress on embryo development. In experiment 1, straws from five Nelore bulls were subjected to a 1 hour incubation at 38,5 ºC and 5% CO2, with increase doses of hydrogen peroxide (0; 12,5; 25; e 50 µM). At the end of incubation period, motility parameters were evaluated by Computed Assisted System Analysis (CASA). Based on the results of the experiment 1, experiment 2 was designed to study a high (50 µM) and a low (12,5 µM) dose of hydrogen peroxide and also a control (0 µM). Sperm samples were incubated with each dose for 1 hour and subsequently used for in vitro fertilization (D=0). Samples were analyzed by CASA, oxidative status (CellROX® green and 2'-7' diclorofluorescein diacetate - DCFH), mitochondrial potential (JC-1), chromatin (LA) and sperm capacitation status (chlortetraciclin). Embryos were evaluated based on fast cleavage rate (30 hours pos-insemination), cleavage rate (D=3), development rate (D=5) and blastocyst rate (D=8). Statistical analysis was performed by polynomial regression model, considering significant a p≤0,05. A dose-dependent deleterious effect of hydrogen peroxide was observed on most motility variables evaluated by CASA, including the percentage of motile cells. Similarly, a dose-dependent increase was observed on the percentages of positive cells for CellROX®, capacitated sperm and also for LA. A decrease on the percentage of cleaved embryos and blastocyst was observed as hydrogen peroxide increased. Interestingly, a blockage was detected during the 2-4 cell stage. In these conditions when exposed to oxidative environment, sperm may present disabled motility characteristics, oxidative status and premature capacitation and such abnormalities result on impaired embryo development, from the first cleavage to blastocyst.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-16032015-102623 |
| Date | 27 November 2014 |
| Creators | Letícia Signori de Castro |
| Contributors | Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção, Ricardo Pimenta Bertolla, Marcella Pécora Milazzotto |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Reprodução Animal, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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