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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose é uma doença endêmica no Brasil causada por parasitos
protozoários do gênero Leishmania. A quimioterapia continua sendo a forma mais
efetiva de tratamento com os antimoniais pentavalentes sendo usados há mais de
70 anos como a primeira linha de tratamento. O uso deste e de outros fármacos
apresenta efeitos adversos graves, os esquemas terapêuticos empregados são
desconfortáveis, além de relatos do aumento de casos de resistência. A proteína de
choque térmico 90 (HSP90) é um membro da família das chaperonas presente em
células eucarióticas e bactérias. Essa proteína é fundamental para o dobramento e
estabilização de diferentes proteínas, chamadas genericamente de proteínas
cliente. Essa chaperona vem sendo considerada um importante alvo molecular para
o tratamento de diferentes doenças parasitárias. Nessa tese, o inibidor específico da
atividade ATPásica da HSP90, o 17-allilamino-17-demethoxigeldanamicina (17-
AAG) foi testado em parasitos do gênero Leishmania. Inicialmente, avaliamos o
efeito em cultura axênica e observamos que o 17-AAG causa a morte desses
parasitos em concentrações inferiores às necessárias para causar a morte de
macrófagos. Observamos também que o tratamento com 17-AAG promove a morte
intracelular dos parasitos em concentrações que variam de 25 a 500 nM nos
tempos de 24 e 48 h, sendo também eficaz contra a forma amastigota em tempos
mais tardios como 96 h de infecção. Os parasitos morrem independentemente da
produção de moléculas microbicidas pelo macrófago, como superóxido e óxido
nítrico, que tiveram sua produção reduzida em 61 e 58 %, respectivamente. O
tratamento com 17-AAG também reduziu a produção de mediadores próinflamatórios
como TNF-α, IL-6 e MCP-1 em 35, 35 e 92 %, respectivamente.
Utilizando o modelo de camundongos BALB/c infectados por Leishmania braziliensis
na orelha demonstramos que o tratamento com 17-AAG causou redução do
tamanho da lesão cutânea em 0,5 mm e da carga parasitaria no local da infecção
em 25 %, no entanto, não foi capaz de reduzir a carga parasitaria no linfonodo
drenante. Análise por microscopia eletrônica de transmissão de macrófagos
infectados e tratados com 17-AAG revelou alterações características de um
processo autofágico com vacuolização do citoplasma e formação de vacúolos com
dupla membrana, além da presença de figuras de mielina. Utilizando parasitos
transgênicos observamos que 17-AAG induz um aumento de 30 % na formação de
autofagossomos, que tem a sua capacidade de fusão com glicossomos e
lisossomos reduzida. Além disso, parasitos ATG5 knockout, incapazes de formar
autofagossomos foram cerca de 90% mais resistentes à morte induzida pelo AAG em relação a parasitos selvagens. Observamos, também, que o tratamento
com MG132, um inibidor da atividade do proteassoma, assim como o 17-AAG
induziu o acúmulo de proteínas ubiquitinadas de parasitos, especialmente em
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parasitos incapazes de formar autofagossomos, sugerindo um papel da autofagia na
degradação de proteínas ubiquitinadas. Por último, observamos que o MG132 foi
capaz de induzir a formação de autofagossomos sugerindo uma ligação entre o
acúmulo de proteínas ubiquitinadas e a indução da via autofágica. Em conjunto,
nossos resultados indicam que o HSP90 é um alvo molecular que dever ser
explorado no tratamento das leishmanioses. / Leishmaniases are endemic disease in Brazil caused by protozoan parasites from
the genus Leishmania. Chemotherapy remains the most effective way of treatment
and pentavalent antimonials, used for more than 70 years, remaining as first choice
drugs for leishmaniasis treatment. The use of this and other drugs causes severe
side effects, therapeutic regimens employed for leishmaniasis treatment are
unpleasant, besides an increase number of resistance cases. The Heat Shock
Protein 90 (HSP90) is a member of the chaperone family present in bacteria and
eukaryotic cells. This protein is essential for the folding and stabilization of different
proteins, known as client proteins. This chaperone has been considered an
important molecular target for the treatment of different parasitic diseases. In this
thesis, the specific inhibitors of the ATPase activity from the HSP90, 17-allylamino-
17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), were tested against parasites from the genus
Leishmania. First we evaluated its effect on axenic culture and observed that 17-
AAG induces parasite cell death in lowerconcentrations than those needed to induce
macrophage cell death. We also observed that 17-AAG intracellular parasite death in
concentrations ranging from 25 to 500 nM after 24 or 48 h, being also able to kill
amastigotes in latter times of infection, such as 96 h. The parasites die
independently of the production of microbicide molecules, such as superoxide and
nitric oxide, which had their production reduced by 61 and 58 %, respectively. 17-
AAG treatment also reduced the production of pro-inflammatory molecules such as
TNF-α, IL-6 e MCP-1 in 35, 35 and 98 %, respectively. Using the murine model of
BALB/c mice infected with Leishmania braziliensis in the ear showed that treatment
of 17-AAG reduces the size of the lesion in 0,5 mm and the parasite load in the ear
in 25 %, however, the treatment wasn’t able to reduce the parasite load in the
draining lymph node. Transmission electron microscopy analysis of infected
macrophages treated with 17-AAG revealed alterations typical of autophagic process
with cytoplasm vacuolization, formation of vacuoles with double membranes, besides
the presence of myelin figures. Using transgenic parasites we observed that 17-AAG
induces an increase of 35 % in the autophagosome formation witch have their ability
to fuse with glycosome and lisosome reduced. However, in comparison to wild type
parasites, ATG5 knockout parasites that are unable to form autophagosome were
90% more resistant to 17-AAG-induced cell death. We also observed that MG132
treatment, a proteasome inhibitor, like 17-AAG induced ubiquitined proteins
accumulation in parasites, especially in parasites unable to form autophagosome,
suggesting a role of autophagy in degradation of ubiquitinated proteins. Lastly, we
observed that MG132 induced autophagosome formation, suggesting a link between
ubiquitinated and induction of the autophagic pathway. In sum, our results indicate
that HSP90 is a molecular target that should be explored as a treatment for
leishmaniasis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12467 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Petersen, Antonio Luis de Oliveira Almeida |
| Contributors | Lima, Ana Paula Cabral de Araújo, Castilho, Marcelo Santos, Machado, Paulo Roberto Lima, Soares, Milena Pereira Botelho, Veras, Patricia Sampaio Tavares, Veras, Patricia Sampaio Tavares |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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