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Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A capacidade do Trypanosoma cruzi de reconhecer moléculas na superfície de células fagociticas e não-fagociticas profissionais é essencial para sua sobrevivência no hospedeiro vertebrado. O papel de proteoglicanos sulfatados no processo de reconhecimento celular tem sido relatado em muitos patógenos humanos, incluindo o T. cruzi. Dados do nosso grupo demonstraram a participação de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) de cardiomiócitos na invasão por formas tripomastigotas. Entretanto, a estrutura da molécula de PGHS envolvida na interação receptor-ligante e o papel de outros glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados no processo de invasão ainda não foram elucidados. Para avaliar a participação dos GAGs na invasão do T. cruzi, tripomastigotas, clone Dm28c, foram pré-tratados com 20µg/ml de heparina, queratam sulfato (KS) ou três fragmentos distintos de heparam sulfato (HS), os quais foram obtidos por tratamento enzimático (heparitinase I e II) e ácido nitroso. Nos ensaios de competição, os parasitas controles ou pré-tratados com GAGs solúveis foram incubados por 2hs a 37°C com culturas de cardiomiócitos e o percentual de infecção foi determinado após coloração pelo Giemsa. Nossos resultados revelaram uma inibição significante no índice de infecção de 84,8% e 45% após tratamento dos parasitas com heparina e com o fragmento N-acetilado/N-sulfatado (NA/NS), respectivamente, sugerindo o importante papel do domínio ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]3-[GlcUA-GlcNAc]4[GlcNAc]), da cadeia de HS no reconhecimento T. cruzi-cardiomiócito. Em contraste, o tratamento dos parasitas com KS, fragmento N-acetilado ou N-sulfatado não apresentou efeito no processo de invasão. O papel da sulfatação no processo de reconhecimento e invasão foi avaliado pelo tratamento de culturas de cardiomiócitos por 16hs a 37°C com diferentes concentrações de clorato de sódio e posteriormente, infectados com tripomastigotas (2hs)...
(...) O declínio da sulfatação resultou na redução (dose dependente) do índice de infecção, alcançando níveis de inibição de 26%, 48,5% e 73,6% após o tratamento de cardiomiócitos com 25 mM, 50 mM e 75 mM de clorato de sódio, respectivamente, sugerindo a participação da carga negativa como moduladora do reconhecimento específico com o domínio NA/NS da cadeia de HS. Adicionalmente, ensaios bioquímicos foram realizados para caracterizar a proteína de ligação a heparina presente na superfície do T. cruzi. Duas bandas majoritárias de 65,8 kDa e 59 kDa foram identificadas no extrato protéico total das 3 formas evolutivas do T. cruzi por Western blotting, utilizando heparina, condroitim sulfato (CS) e HS conjugados a biotina. O ligante de heparina de T. cruzi foi isolado pela associação do método do Triton X-114 e cromatografia de afinidade a heparina-Sepharose. Após marcação metabólica (35S-Metionina), as proteínas hidrofóbicas foram isoladas em coluna de afinidade e separadas por SDS-PAGE, revelando um perfil protéico, similar ao extrato total, com duas bandas majoritárias (65,8 kDa e 59 kDa) eluídas com 0,5 M e 1,0 M de NaCl em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. A análise isotópica também revelou uma expressão superior deste ligante (1,3-2 vezes) em tripomastigotas quando comparado com epimastigotas. As proteínas de ligação a heparina (65,8 kDa e 59 kDa) foram detectadas na fração de membrana de epimastigotas obtida pelo método de fracionamento subcelular associado a purificação em coluna de afinidade. A detecção das proteínas eluídas da coluna de afinidade a heparina por Western blotting com heparina-, HS- e CS-biotinilados revelou intensa marcação principalmente na proteína de 59 kDa. Além disso, a análise das proteínas por eletroforese não desnaturante revelou a presença de duas bandas nas formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi...
(...) Ensaios bioquímicos complementares serão realizados a fim de obter informações detalhadas sobre a proteína de ligação a heparina de T. cruzi. / The ability of
Trypanosoma cruzi
to recognize molecules at the surface of both the
phagocytic and non-phagocytic cells is essential to
its survival in the vertebrate host. The
role of the sulfated proteoglycans in the cell reco
gnition process has been reported in several
human pathogens, including
T. cruzi
. Data from our group have demonstrated the
participation of heparan sulfated proteoglycan (HSP
G) of cardiomyocytes in the invasion for
forms trypomastigotes. However, the structure of th
e HSPG molecule involved in the
receptor-ligand interaction and the role of other s
ulfated glycosaminoglycans (GAGs) in the
invasion process have not been elucidated yet.
To evaluate the participation of GAGs in
T. cruzi
invasion, trypomastigotes, clone
Dm28c, were pre-treated with 20μg/ml of heparin, ke
ratan sulfate (KS) or three distinct
fragments of heparan sulfate (HS) obtained by enzym
atic (heparitinase I and II) and nitrous
acid treatments. For competition assays, the untrea
ted or soluble GAGs pre-treated
parasites were incubated for 2h at 37°C with the ca
rdiomyocyte cultures and the percentage
of infection was determined after Giemsa staining.
Our results revealed a significant
inhibition of the infection index of 84.8% and 45%
after treatment of the parasites with
heparin and the N-acetylated/ N-sulfated fragment,
respectively, suggesting the important
role of the
([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]
3
-[GlcUA-GlcNAc]
4
[GlcNAc])
domain of the HS chain in
the
T. cruzi
-cardiomyocyte recognition. In contrast, the treatm
ent of the parasites with KS, N-
acetylated or N-sulfated fragments did not display
any effect in the invasion process. The
role of sulfation in the recognition and invasion p
rocess was evaluated by treating the
cardiomyocytes cultures for 16h at 37°C with differ
ent concentrations of sodium chlorate,
followed by trypomastigotes infection (2h). The dec
line of sulfation resulted in the reduction
(dose dependent) of the infection index, achieving
inhibition levels of 26%, 48.5% and 73.6%
after treatment of cardiomyocyte cultures with 25mM
, 50mM and 75mM of sodium chlorate,
respectively, suggesting the participation of negat
ive charge as modulator of the specific
recognition with the NA/NS domain of HS chain.
Additionately, biochemical assays were performed to
characterize the heparin binding
protein present at the surface of
T. cruzi
. Two major protein bands of 65.8 kDa and 59 kDa
were identified in the total protein extract of all
evolutive forms of
T. cruzi
by
Western blotting
,
using biotin conjugated-heparin, -chondroitin sulfa
te (CS) and -HS. The
T. cruzi
heparin
ligand was isolated by association of Triton X-114
extraction method and heparin-Sepharose
affinity chromatography. After metabolic labeling (
35
S-Methionine), the hydrophobic proteins
were isolated by affinity column and separated by S
DS-PAGE, revealing a protein profile,
similar to total protein extract, with two major ba
nds (65.8 kDa and 59 kDa) eluted with 0.5M
and 1M NaCl in trypomastigotes and epimastigotes, r
espectively. The isotopic analysis also
revealed a higher expression of heparin ligand (1.3
-2X) in trypomastigotes when compared
to epimastigotes. The heparin binding proteins were
detected at membrane fraction of
epimastigotes obtained by cell fractionation method
ology associated to the affinity column
purification. The detection of proteins eluted from
heparin affinity column with biotinilated
heparin, CS and HS by
Western blotting
revealed intense labeling mainly at the 59 kDa
protein. In addition, the analysis of the proteins
by denaturant electrophoresis revealed the
presence of two protein band in both trypomastigote
s and epimastigotes forms of
T. cruzi
.
Complementary biochemical assays will be carried ou
t to get more detailed information about
the
T. cruzi
heparin binding protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12863 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Oliveira Junior, Francisco Odencio Rodrigues de |
| Contributors | Perales, Jonas Enrique Aguilar, Porcionatto, Marimélia, Silva, Narcisa Leal da Cunha e, Valle Matta, Maria Adelaide do, D’avila, Claudia, Pereira, Mirian Claudia de Souza, Meirelles, Maria de Nazareth SL de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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