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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / ntrodução e objetivos: O glioblastoma multiforme é um glioma de alto grau que apresenta um prognóstico ruim. O diagnóstico definitivo é estabelecido pela avaliação histológica, porém este pode apresentar conflitos na classificação, com isso surge à necessidade de ferramentas que auxiliem o patologista em sua análise. Atualmente, maior ênfase tem sido dada a alterações na glicosilação, pois estão associadas a neoplasias, e a descoberta da capacidade de lectinas em reconhecer tais alterações fez destas, ferramentas aplicáveis para o diagnóstico biomédico. Dessa forma, o objetivo deste trabalho é analisar a marcação das lectinas CpL, WGA e Con A em células da linhagem C6 e astrócitos. Métodos: As células foram cultivadas em condições estéreis, a 37ºC em atmosfera com 5 % de CO2 até atingirem confluência. Em seguida, foram lavadas com PBS e marcadas com as lectinas CpL, WGA e Con A numa concentração de 1 mg/ml, o controle negativo foi obtido com adição do carboidrato inibidor das lectinas (D-galactose, β-N-acetilglucosamina e glicose), respectivamente, numa concentração de 0,1 M. A incubação se deu por uma hora com proteção da luz, a análise foi realizada em microscópio de fluorescência. Para a quantificação em citometria de fluxo, as células foram marcadas obedecendo ao mesmo protocolo anterior, com exceção do tempo de incubação que se deu por 15 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas, centrifugadas, transferidas para tubos e ressuspensas em PBS para a realização da leitura em citômetro. Resultados: A lectina CpL apresentou melhor marcação para os astrócitos, porém, ainda assim, mostra baixo desempenho comparado com as demais lectinas. Já a lectina WGA apresentou marcação eficiente tanto para astrócitos quanto para as células C6, esta última apresentou o dobro de emissão. Desta forma, é possível inferir que as lectinas CpL e WGA não são capazes de reconhecer diferenças importantes no perfil de glicoconjugados nas membranas das células C6 e dos astrócitos. Entretanto, a lectina Con A revelou marcação eficiente em relação às células C6 capaz de definir a forma celular, mostrando que há uma distribuição quase uniforme destes carboidratos ao longo da superfície da membrana, e ainda exibiu mediana de fluorescência cerca de 99 vezes superior em relação aos astrócitos. Assim, a Con A mostrou ser um marcador capaz de diferenciar as células da linhagem de glioma murino das células de cultura primária. Conclusão: Com base nestes resultados podemos inferir que a lectina Con A pode auxiliar numa identificação mais eficiente com possibilidade de um diagnóstico mais seguro. / Introduction and objectives: Glioblastoma multiforme is a high-grade glioma that has a poor prognosis. The definitive diagnosis is established by histological assessment. However, this can present conflicts in grading gliomas, which justifies new tools to assist the pathologist in his analysis. Currently, it is known that there are changes in glycosylation pattern of molecules associated with cancer, and the discovery of the ability of lectins to recognize these changes made these tools applicable for biomedical diagnosis. Thus, the aim of this study is to analyze the labelling of C6 and astrocyte lineage cells with fluorescent lectins CpL, WGA and Con A. Methods: The cells were cultured under sterile conditions at 37°C in an atmosphere with 5% CO2 until they reached confluence. They were then washed with PBS and labeled with CpL, WGA, or Con A lectins in a concentration of 1 mg/ml. Negative controls were incubated with the carbohydrate that competitively inhibits the reaction (D-galactose, β-N-acetylglucosamine and glucose, respectively), at a concentration of 0.1 M. The incubation occurred for one hour with protection from the light, the analysis was performed on a fluorescence microscope. For flow cytometry quantitation, cells were labeled following the same previous protocol, except that the incubation time was 15 minutes. Subsequently, the cells were washed, centrifuged, transferred to tubes and resuspended in PBS to carry out the reading on a cytometer. Results: The CpL lectin better labeled astrocytes. However, it showed a poor performance compared to other lectins. On the other hand, the WGA lectin efficiently marked both astrocytes and C6 cells; the latter presented the double emission compared to the former. Thus, it is possible to infer that the CpL and WGA lectins are not able to recognize important differences in the glycosylation profile in the membranes of C6 cells and astrocytes. However, the lectin Con A efficiently marked C6 cells, defining their morphology and showing that there is a nearly uniform distribution of glucose along the surface of the membrane, which was not observed in astrocytes. This also exhibited a median fluorescence about 99 times greater than that obtained for astrocytes. Thus, Con A showed to be a marker capable of differentiate cells of murine glioma lineage from primary astrocytes. Conclusion: Based on these results we can infer that the Con A lectin may be a tool for a more efficient identification of glioma cells in histopathological analysis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13028 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Farias, Alana Alves |
| Contributors | Menezes, Diego Silva, Bezerra, Daniel Pereira, El-Bachá, Ramon dos Santos, El-Bacha, Ramon dos Santos |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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