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Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os tripanossomatídeos não sintetizam o colesterol e sim esteróis com o esqueleto ergostano, porém um percentual significativo de colesterol exógeno é encontrado em todas as espécies de Leishmania, sugerindo um papel biológico para esta molécula. Esta tese tem como objetivo estudar a importância do uso de colesterol para Leishmania spp. em várias situações, avaliando o potencial deste sistema como um possível alvo farmacológico. A atividade dos inibidores de biossíntese de ergosterol associado com inibidores de transporte de colesterol derivado de LDL, foi avaliada em promastigotas e amastigotas intracelulares. A associação entre LBqT01 e cetoconazol, miconazol ou terbinafina mostrou sinergia. A associação entre a imipramina ou progesterona e cetoconazol ou terbinafina indicaram um efeito aditivo. O cetoconazol e miconazol demonstraram uma diminuição de até duas vezes o valor de IC50 nas formas amastigotas, quando combinado com os inibidores de transporte de colesterol. Foi observado também alteração da biossíntese de ergosterol após tratamento dos parasitos com os inibidores de transporte de colesterol, demonstrado por CG/MS. A combinação de LBqT01 e cetoconazol mostrou ser mais ativa in vivo do que cada fármaco individualmente. Estudamos também o mecanismo de resistência desses inibidores, avaliando a modulação de enzimas da via de biossíntese de esteróis e a utilização de colesterol exógeno pelos parasitos. Promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis e Leishmania guyanensis foram cultivadas com concentrações crescentes de sinvastatina, terbinafina e miconazol
Estes inibidores mostraram um índice de resistência de 2,5 - 8 vezes. A resistência cruzada também foi avaliada, com estes inibidores e fármacos de referência (miltefosina, anfotericina B e antimônio trivalente). A expressão de genes da biossíntese de esterol e utilização do colesterol exógeno entre as cepas selvagens e resistentes, foram avaliadas por PCR em tempo real e CG/MS, respectivamente. As enzimas HMGCoA e C -14 desmetilase foram as mais moduladas, independente do fármaco utilizado, variando sua expressão nas cepas resistentes. Promastigotas de L. braziliensis resistentes à terbinafina apresentaram alteração no perfil de esteróis, L. amazonensis resistente aos três inibidores e L. guyanensis resistente ao miconazol mostraram alteração da biossíntese de esteróis e aumento na absorção do colesterol exógeno. Os resultados mostram que alguns genes foram amplificados na cepa resistente em relação à cepa selvagem. Juntos estes resultados sugerem que o colesterol desempenha um papel importante na atividade e resistência aos inibidores da biossíntese de esteróis e que o bloqueio da sua utilização pela Leishmania spp. pode ser um alvo para a síntese de novos fármacos para o tratamento da leishmaniose / The trypanosomes do not synthesize cholesterol sterols but with ergostane skeleton, but
a significant percentage of exogenous cholesterol is fou
nd in all species of
Leishmania
,
suggesting a biologica
l rol
e for this molecule. This work
aims to study the
importance
of use
cholesterol to
Leishmania spp
. in several cases
, evaluating the potential of the
s
ystem as a possible drug target
. The activity of the inhibitors of ergosterol biosynthesis
inhibitors
associated with transport of LDL cholesterol derivative was evaluated in
intracellula
r amastigotes and promastigotes
. The association
between LBqT01 and
ketoconazole
, miconazol
e or terbinafine showed synergy
. The association bet
ween
imipramine or progester
one, and ketoconazole
, or terbinafine indica
ted an additive
effect
. The ketoconazole and miconazole showed a reduction of up to twice the IC50
value in amastigotes when combined with the inhi
bitors of cholesterol transport
. Change
of ergosterol biosynthesi
s of parasites after treatment with inhibitors of cholesterol
transport as demonstrat
ed by GC/MS was also observed
. The combination of LBqT01
and ketoconazole was more active in vivo than either drug individually. We also studied
the mechanism of resistanc
e of these inhibitors by evaluating the modulation of
enzymes of the sterol biosynthesis pathway and use of exo
genous cholesterol by
parasites
. Promastigotes of
Leishmania amazonensis
,
Leishmania braziliensis
and
Leishmania guyanensis
were cultured with in
creasing concentrations of simvastati
n,
terbinafine and miconazole
. These inhibitors showed resis
tance index from 2.5 to 8
times
. Cross
-
resistance was evaluated with these inhibitors an
d reference drugs
(miltefosine
, amphot
ericin B and trivalent antimony)
.
The expression of sterol
biosynthesis genes and use of exogenous cholesterol in the wild and resistant strains
were analyz
ed by real
-
time PCR and GC / MS
, respectively. The HMGCoA C and
-
14
demethyl
ase enzymes were more modulated, regardless of the drug u
sed
, varying its
expression
in resistant strains
. Promastigotes of
L. braziliensis
resistant to terbinafine
pres
ented changes in sterol profile,
L. amazonensis
resistant to all three inhibitors
amazonensis and
L. guyanensis
miconazole resistant showed alte
rations in the
biosynthesis of sterols and increase in the absorption of exogenous cholesterol. The
results show that some genes were amplified in the resistant strain c
ompared to the wild
type strain
. Together these results suggest that cholesterol plays
an important role in the
activity and resistance to inhibitors of sterol biosynthesis and blocking their use
Leishmania spp
. may be a target for the synthesis of new drugs for the treatment of
leishmaniasis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13171 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Andrade Neto, Valter Viana de |
| Contributors | Levy, Cláudia Masini d'Avila, Bergmann, Bartira Rossi, Monte Neto, Rubens Lima do, Amaral, Elmo Eduardo de Almeida, Barreto, Rubem Figueiredo Sadok Menna, Santos, Eduardo Caio Torres do |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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