Na simbiose entre soja e bactérias diazotróficas ocorre o processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) no nódulo. Nessa associação há uma comunicação constante, pois a liberação de exsudatos pela planta é percebida pela bactéria, que, então, produz lipo-quito-oligossacarídeos, chamados fatores Nod (FNs), moléculas de sinalização na nodulação. Esses FNs são produtos da atividade dos genes nod bacterianos. Os genes nod regulatórios codificam fatores de transcrição (FTs) responsáveis pela regulação dos genes nod estruturais, que codificam enzimas para a biossíntese dos FNs. Na região promotora dos genes nod atua o FT NodD, que se liga em sequências específicas conservadas, chamadas nod boxes. Essa comunicação abrange a regulação de vários genes, como os genes nod regulatórios nodD1 e nodD2 de Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587. Bradyrhizobium elkanii são bactérias Gram-negativas, fixadoras de nitrogênio, usadas comercialmente para a produção de inoculantes na agricultura, devido à eficiência do processo de FBN na simbiose, o que justifica o interesse em torno dessa interação. No micro-organismo modelo Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110, as proteínas NodD1 e NodD2, sintetizadas a partir dos genes nodD1 e nodD2, respectivamente, têm ações contrárias. Enquanto NodD1 age como um regulador transcricional positivo dos operons nod e regula a sua própria transcrição, NodD2 atua como um regulador negativo desses operons. Isso despertou o interesse de investigar o papel dessas proteínas em B. elkanii SEMIA 587, com a finalidade de testar se elas apresentam funções semelhantes àquelas demonstradas na estirpe padrão USDA110. Sendo assim, o objetivo do trabalho foi contribuir, através da aplicação de diferentes metodologias, para um melhor entendimento em relação à regulação dos genes nod em B. elkanii SEMIA 587. Para tanto, fragmentos de DNA contendo os genes nodD1 e nodD2 dessa bactéria foram clonados nos vetores pGEM e pGEX-4T2, para produção das proteínas recombinantes em Escherichia coli BL21, a fim de realizar experimentos de retardamento em gel para comprovar a ligação das proteínas NodD1 e NodD2 nos nod boxes identificados nas regiões reguladoras dos respectivos genes, bem como determinar a eficiência de cada ligação. A expressão de ambas as proteínas em E. coli foi visualizada em gel SDS-PAGE e as proteínas estão em fase de purificação. Clonagens posteriores realizadas usando o sistema Gateway® para inserção dos genes nodD1 e nodD2 no vetor de clonagem pENTR foram confirmadas por sequenciamento e recombinadas a dois vetores de levedura (pDEST-22 e pDEST-32). Esses procedimentos visam à execução de ensaios de duplo híbrido para verificar se as proteínas NodD1 e NodD2 são capazes de formar heterodímeros funcionais. / The process of Biological Nitrogen Fixation (BNF) in the symbiosis between soybean and diazotrophic bacteria occurs in the nodule. There is a constant communication in this association. Plant exudates are perceived by the bacteria that produce lipo-chito-oligosaccharides (LCOs), called Nod Factors (NF), signaling molecules in nodulation. These NFs are product of bacterial nod genes activity. Transcription Factors (TFs) are encoded by regulatory nod genes, responsible for structural nod genes regulation. These structural nod genes encode enzymes for NFs biosynthesis. TF NodD acts in the promoter region of nod genes and binds to specific conserved sequences, called nod boxes. The Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587 regulatory nod genes nodD1 and nodD2 are involved in this communication. B. elkanii are diazotroph gram-negative bacteria used commercially as inoculants source in agriculture, due to the efficiency of the BNF process in the symbiosis, which justifies the interest regarding this interaction. NodD1 and NodD2 proteins are synthesized by nodD1 and nodD2 and display contrary actions in the model strain B. diazoefficiens USDA 110. While NodD1 acts as a positive transcriptional regulator of nod operons and regulates its own transcription, NodD2 acts as a negative regulator of these operons. These proteins roles in B. elkanii SEMIA 587 aroused the interest of investigating, in order to test whether they have similar functions to those demonstrated in the model strain. Therefore, the goal of this work was to contribute, through the application of different methodologies, to a better understanding regarding nod genes regulation in B. elkanii SEMIA 587. B. elkanii SEMIA 587 nodD1 and nodD2 coding sequences were cloned into pGEM and pGEX-4T-2 vectors. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli BL21 in the order to carry out gel retardation experiments to verify purified proteins binding to the nod boxes identified in nod promoters, as well as the efficiency of each binding. The expressed proteins in E. coli were visualized by SDS-PAGE and are undergoing purification. Subsequent cloning was realized with the Gateway® system for nodD1 and nodD2 insertion into pENTR vector. The constructs were confirmed by sequencing and recombined to yeast vectors (pDEST-22 and pDEST-32).These procedures aim to perform two-hybrid assays to verify if NodD1 and NodD2 are capable of forming functional heterodimers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.lume.ufrgs.br:10183/187249 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Santos, Priscila Silveira dos |
| Contributors | Passaglia, Luciane Maria Pereira, Carvalho, Gabriela de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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