O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis SBR5T é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, interessante modelo para o estudo da regulação da FBN com o genoma completo disponível. O fator de transcrição GlnR foi proposto como regulador dos genes nif em Paenibacillus spp. a partir de análises in silico. O presente trabalho identificou sítios de ligação de GlnR em promotores de genes envolvido com a FBN e validou o papel de GlnR como regulador negativo dos genes nif em P. riograndensis. Também foi demonstrado que a enzima glutamina sintetase interage com GlnR quando está inibida por feedback e estabiliza a ligação de GlnR às regiões reguladoras dos genes nif. Um modelo de repressão baseado em operadores múltiplos foi proposto integrando a regulação da FBN à regulação global do nitrogênio exercida por GlnR. Na tentativa de identificar elementos específicos relacionados à regulação do molibdênio (componente do cofator enzimático) e da nitrogenase alternativa (com cofator independente de molibdênio), foi acessado o perfil transcricional de P. riograndensis sob condições de limitação de nitrogênio e molibdênio. Alguns fatores de transcrição especificamente induzidos sob tais condições e provavelmente relacionados à homeostase de metais foram identificados. Com relação à glutamina sintetase, além da demonstração da interação entre a enzima e o fator de transcrição GlnR, duas proteínas adicionais homólogas de glutamina sintetase e que não participam dessa regulação foram identificadas codificadas no genoma. Uma delas foi caracterizada como glutamina sintetase funcional, enquanto a outra não apresentou atividade bioquímica. Além disso, um protocolo para transformação da linhagem em estudo foi estabelecido e otimizado, o que permitirá aprofundar os estudos de genética molecular tanto da FBN como de outros processos de interesse em P. riograndensis. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gram-negative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis SBR5T is a Grampositive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. The transcription factor GlnR has been proposed as the nif regulator in Paenibacillus spp. based on in silico analysis. The present work identified GlnR-binding sites at BNFrelated promoters and validated GlnR role as nif negative regulator in P. riograndensis. It was also demonstrated that the feedback-inhibited glutamine synthetase enzyme interacts with GlnR and stabilizes its binding activity in the nif genes promoters. A multiple operator model was proposed to integrate BNF regulation and the global nitrogen regulation coordinated by GlnR. In an effort to identify specific regulatory elements related to molybdenum (enzymatic cofactor component) and the alternative nitrogenase (which presents a molybdenum-independent cofactor), the transcriptional profile of P. riograndensis was accessed under nitrogen and molybdenum limiting conditions. Transcription factors specifically induced under such conditions and probably related to metal homeostasis were identified. Regarding the glutamine synthetase, two additional glutamine synthetase homologs that do not take part in GlnR regulation were identified. One of them was characterized as a functional glutamine synthetase, while the other did not display biochemical activity. Also, a protocol to transform the model in study was established and optimized. This protocol allows the development of further molecular research to unveil BNF and other interesting processes in P. riograndensis.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis SBR5T é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, interessante modelo para o estudo da regulação da FBN com o genoma completo disponível. O fator de transcrição GlnR foi proposto como regulador dos genes nif em Paenibacillus spp. a partir de análises in silico. O presente trabalho identificou sítios de ligação de GlnR em promotores de genes envolvido com a FBN e validou o papel de GlnR como regulador negativo dos genes nif em P. riograndensis. Também foi demonstrado que a enzima glutamina sintetase interage com GlnR quando está inibida por feedback e estabiliza a ligação de GlnR às regiões reguladoras dos genes nif. Um modelo de repressão baseado em operadores múltiplos foi proposto integrando a regulação da FBN à regulação global do nitrogênio exercida por GlnR. Na tentativa de identificar elementos específicos relacionados à regulação do molibdênio (componente do cofator enzimático) e da nitrogenase alternativa (com cofator independente de molibdênio), foi acessado o perfil transcricional de P. riograndensis sob condições de limitação de nitrogênio e molibdênio. Alguns fatores de transcrição especificamente induzidos sob tais condições e provavelmente relacionados à homeostase de metais foram identificados. Com relação à glutamina sintetase, além da demonstração da interação entre a enzima e o fator de transcrição GlnR, duas proteínas adicionais homólogas de glutamina sintetase e que não participam dessa regulação foram identificadas codificadas no genoma. Uma delas foi caracterizada como glutamina sintetase funcional, enquanto a outra não apresentou atividade bioquímica. Além disso, um protocolo para transformação da linhagem em estudo foi estabelecido e otimizado, o que permitirá aprofundar os estudos de genética molecular tanto da FBN como de outros processos de interesse em P. riograndensis. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gram-negative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis SBR5T is a Grampositive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. The transcription factor GlnR has been proposed as the nif regulator in Paenibacillus spp. based on in silico analysis. The present work identified GlnR-binding sites at BNFrelated promoters and validated GlnR role as nif negative regulator in P. riograndensis. It was also demonstrated that the feedback-inhibited glutamine synthetase enzyme interacts with GlnR and stabilizes its binding activity in the nif genes promoters. A multiple operator model was proposed to integrate BNF regulation and the global nitrogen regulation coordinated by GlnR. In an effort to identify specific regulatory elements related to molybdenum (enzymatic cofactor component) and the alternative nitrogenase (which presents a molybdenum-independent cofactor), the transcriptional profile of P. riograndensis was accessed under nitrogen and molybdenum limiting conditions. Transcription factors specifically induced under such conditions and probably related to metal homeostasis were identified. Regarding the glutamine synthetase, two additional glutamine synthetase homologs that do not take part in GlnR regulation were identified. One of them was characterized as a functional glutamine synthetase, while the other did not display biochemical activity. Also, a protocol to transform the model in study was established and optimized. This protocol allows the development of further molecular research to unveil BNF and other interesting processes in P. riograndensis.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis SBR5T é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, interessante modelo para o estudo da regulação da FBN com o genoma completo disponível. O fator de transcrição GlnR foi proposto como regulador dos genes nif em Paenibacillus spp. a partir de análises in silico. O presente trabalho identificou sítios de ligação de GlnR em promotores de genes envolvido com a FBN e validou o papel de GlnR como regulador negativo dos genes nif em P. riograndensis. Também foi demonstrado que a enzima glutamina sintetase interage com GlnR quando está inibida por feedback e estabiliza a ligação de GlnR às regiões reguladoras dos genes nif. Um modelo de repressão baseado em operadores múltiplos foi proposto integrando a regulação da FBN à regulação global do nitrogênio exercida por GlnR. Na tentativa de identificar elementos específicos relacionados à regulação do molibdênio (componente do cofator enzimático) e da nitrogenase alternativa (com cofator independente de molibdênio), foi acessado o perfil transcricional de P. riograndensis sob condições de limitação de nitrogênio e molibdênio. Alguns fatores de transcrição especificamente induzidos sob tais condições e provavelmente relacionados à homeostase de metais foram identificados. Com relação à glutamina sintetase, além da demonstração da interação entre a enzima e o fator de transcrição GlnR, duas proteínas adicionais homólogas de glutamina sintetase e que não participam dessa regulação foram identificadas codificadas no genoma. Uma delas foi caracterizada como glutamina sintetase funcional, enquanto a outra não apresentou atividade bioquímica. Além disso, um protocolo para transformação da linhagem em estudo foi estabelecido e otimizado, o que permitirá aprofundar os estudos de genética molecular tanto da FBN como de outros processos de interesse em P. riograndensis. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gram-negative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis SBR5T is a Grampositive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. The transcription factor GlnR has been proposed as the nif regulator in Paenibacillus spp. based on in silico analysis. The present work identified GlnR-binding sites at BNFrelated promoters and validated GlnR role as nif negative regulator in P. riograndensis. It was also demonstrated that the feedback-inhibited glutamine synthetase enzyme interacts with GlnR and stabilizes its binding activity in the nif genes promoters. A multiple operator model was proposed to integrate BNF regulation and the global nitrogen regulation coordinated by GlnR. In an effort to identify specific regulatory elements related to molybdenum (enzymatic cofactor component) and the alternative nitrogenase (which presents a molybdenum-independent cofactor), the transcriptional profile of P. riograndensis was accessed under nitrogen and molybdenum limiting conditions. Transcription factors specifically induced under such conditions and probably related to metal homeostasis were identified. Regarding the glutamine synthetase, two additional glutamine synthetase homologs that do not take part in GlnR regulation were identified. One of them was characterized as a functional glutamine synthetase, while the other did not display biochemical activity. Also, a protocol to transform the model in study was established and optimized. This protocol allows the development of further molecular research to unveil BNF and other interesting processes in P. riograndensis.

Na simbiose entre soja e bactérias diazotróficas ocorre o processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) no nódulo. Nessa associação há uma comunicação constante, pois a liberação de exsudatos pela planta é percebida pela bactéria, que, então, produz lipo-quito-oligossacarídeos, chamados fatores Nod (FNs), moléculas de sinalização na nodulação. Esses FNs são produtos da atividade dos genes nod bacterianos. Os genes nod regulatórios codificam fatores de transcrição (FTs) responsáveis pela regulação dos genes nod estruturais, que codificam enzimas para a biossíntese dos FNs. Na região promotora dos genes nod atua o FT NodD, que se liga em sequências específicas conservadas, chamadas nod boxes. Essa comunicação abrange a regulação de vários genes, como os genes nod regulatórios nodD1 e nodD2 de Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587. Bradyrhizobium elkanii são bactérias Gram-negativas, fixadoras de nitrogênio, usadas comercialmente para a produção de inoculantes na agricultura, devido à eficiência do processo de FBN na simbiose, o que justifica o interesse em torno dessa interação. No micro-organismo modelo Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110, as proteínas NodD1 e NodD2, sintetizadas a partir dos genes nodD1 e nodD2, respectivamente, têm ações contrárias. Enquanto NodD1 age como um regulador transcricional positivo dos operons nod e regula a sua própria transcrição, NodD2 atua como um regulador negativo desses operons. Isso despertou o interesse de investigar o papel dessas proteínas em B. elkanii SEMIA 587, com a finalidade de testar se elas apresentam funções semelhantes àquelas demonstradas na estirpe padrão USDA110. Sendo assim, o objetivo do trabalho foi contribuir, através da aplicação de diferentes metodologias, para um melhor entendimento em relação à regulação dos genes nod em B. elkanii SEMIA 587. Para tanto, fragmentos de DNA contendo os genes nodD1 e nodD2 dessa bactéria foram clonados nos vetores pGEM e pGEX-4T2, para produção das proteínas recombinantes em Escherichia coli BL21, a fim de realizar experimentos de retardamento em gel para comprovar a ligação das proteínas NodD1 e NodD2 nos nod boxes identificados nas regiões reguladoras dos respectivos genes, bem como determinar a eficiência de cada ligação. A expressão de ambas as proteínas em E. coli foi visualizada em gel SDS-PAGE e as proteínas estão em fase de purificação. Clonagens posteriores realizadas usando o sistema Gateway® para inserção dos genes nodD1 e nodD2 no vetor de clonagem pENTR foram confirmadas por sequenciamento e recombinadas a dois vetores de levedura (pDEST-22 e pDEST-32). Esses procedimentos visam à execução de ensaios de duplo híbrido para verificar se as proteínas NodD1 e NodD2 são capazes de formar heterodímeros funcionais. / The process of Biological Nitrogen Fixation (BNF) in the symbiosis between soybean and diazotrophic bacteria occurs in the nodule. There is a constant communication in this association. Plant exudates are perceived by the bacteria that produce lipo-chito-oligosaccharides (LCOs), called Nod Factors (NF), signaling molecules in nodulation. These NFs are product of bacterial nod genes activity. Transcription Factors (TFs) are encoded by regulatory nod genes, responsible for structural nod genes regulation. These structural nod genes encode enzymes for NFs biosynthesis. TF NodD acts in the promoter region of nod genes and binds to specific conserved sequences, called nod boxes. The Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587 regulatory nod genes nodD1 and nodD2 are involved in this communication. B. elkanii are diazotroph gram-negative bacteria used commercially as inoculants source in agriculture, due to the efficiency of the BNF process in the symbiosis, which justifies the interest regarding this interaction. NodD1 and NodD2 proteins are synthesized by nodD1 and nodD2 and display contrary actions in the model strain B. diazoefficiens USDA 110. While NodD1 acts as a positive transcriptional regulator of nod operons and regulates its own transcription, NodD2 acts as a negative regulator of these operons. These proteins roles in B. elkanii SEMIA 587 aroused the interest of investigating, in order to test whether they have similar functions to those demonstrated in the model strain. Therefore, the goal of this work was to contribute, through the application of different methodologies, to a better understanding regarding nod genes regulation in B. elkanii SEMIA 587. B. elkanii SEMIA 587 nodD1 and nodD2 coding sequences were cloned into pGEM and pGEX-4T-2 vectors. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli BL21 in the order to carry out gel retardation experiments to verify purified proteins binding to the nod boxes identified in nod promoters, as well as the efficiency of each binding. The expressed proteins in E. coli were visualized by SDS-PAGE and are undergoing purification. Subsequent cloning was realized with the Gateway® system for nodD1 and nodD2 insertion into pENTR vector. The constructs were confirmed by sequencing and recombined to yeast vectors (pDEST-22 and pDEST-32).These procedures aim to perform two-hybrid assays to verify if NodD1 and NodD2 are capable of forming functional heterodimers.

A Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), processo no qual o nitrogênio atmosférico é convertido à amonia, é muito bem estabelecida entre bactérias diazotróficas coletivamente chamadas de rizóbios e espécies leguminosas. No Brasil, esse tipo de associação (simbiótica) supre totalmente a necessidade de nitrogênio na cultura da soja. Para que a infecção seja efetiva e possa resultar na formação de um nódulo capaz de sustentar o processo de FBN conduzido pelo bacterioide, o rizóbio necessita, previamente, reconhecer e responder à presença das raízes da planta compatível. As associações simbióticas entre rizóbios e plantas leguminosas são altamente específicas, de forma que cada espécie, ou até mesmo estirpe de rizóbio, possui uma gama definida de plantas às quais está apto a se associar, e vice-versa. A principal função dos produtos dos genes de nodulação (nod) é garantir a troca de sinais entre os dois organismos envolvidos na relação simbiótica, onde os produtos dos genes nod regulatórios atuam no controle da expressão de genes nod estruturais. A expressão de genes nod estruturais, via de regra, não ocorre de forma autônoma nos micro-organismos simbiontes do gênero Bradyrhizobium, requerendo assim a presença de moléculas sinalizadoras secretadas pelas raízes das plantas (predominantemente flavonoides) e ativadores transcricionais do tipo-LysR – as proteínas NodD regulatórias. Neste contexto, motivos específicos das proteínas NodD ligam-se a sequências conservadas na região promotora do operon nod, conhecidas como nod boxes, mediando a transcrição dos genes nod. Aparentemente, este sistema regulatório envolvendo as proteínas NodD está presente na maioria das estirpes de Rhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium, sugerindo um mecanismo geral de controle da nodulação. Em B. diazoefficiens, duas proteínas NodD foram identificadas, com funções e padrões de expressão distintos: NodD1, ativador da transcrição dos genes nod responsivo aos flavonoides liberados pelas raízes das plantas, e NodD2, com ação contrária, atuando como repressor da transcrição desses genes. Enquanto existe uma quantidade relativamente grande de conhecimento em relação à genética e aos mecanismos moleculares que regulam a expressão dos genes envolvidos na nodulação de B. diazoefficiens, incluindo a sequência completa de seu genoma, informações sobre a genética de B. elkanii ainda são relativamente escassas, mesmo que existam alguns dados genômicos disponíveis. Neste trabalho, sequências genômicas de seis linhagens de B. elkanii foram comparadas com o genoma da linhagem de referência B. diazoefficiens USDA 110 com o objetivo de elucidar mecanismos envolvidos na expressão dos genes nod, especialmente aqueles relacionados ao operon e ao regulon nod. Os resultados obtidos permitiram acrescentar aspectos importantes no modelo de regulação apresentado para a linhagem de referência e que pode ser estendido para linhagens de B. elkanii. / The Biological Nitrogen Fixation (BNF), process in which atmospheric nitrogen is converted to ammonia, is well established among diazotrophs collectively called rhizobia and legume species. In Brazil, this type of symbiotic association fully meets the need for nitrogen in soybean crop. To infection be effective and result in the formation of a nodule able to sustain the BNF process lead by the bacterioid, the rhizobia need previously to recognize and respond to the presence of the root of a compatible plant. The symbiotic associations between rhizobia and leguminous plants are highly specific, so that each species or even strain of rhizobia has a defined range of plants to which it is able to associate, and vice-versa. The main function of the products of nodulation (nod) genes is to guarantee the exchange of signals between the two organisms involved in the symbiotic relationship, where the products of regulatory nod genes act to control the expression of structural nod genes. The expression of structural nod genes usually does not occur independently in the symbiotic microorganisms of the Bradyrhizobium genus, thus requiring the presence of signalling molecules secreted by plant roots (predominantly flavonoids) and transcriptional activators – the LysR-type regulatory NodD proteins. In this context, NodD proteins bind to specific motifs of conserved sequences in the promoter region of the nod operon, known as nod boxes, mediating transcription of the nod genes. Apparently, this regulatory system involving NodD proteins is present in most strains of Rhizobium, Bradyrhizobium and Azorhizobium, suggesting a general mechanism of nodulation control. In B. diazoefficiens two NodD proteins were identified with distinct functions and expression patterns: NodD1, a flavonoid responsive transcriptional activator of nod genes, and NodD2 with counteraction, acting as a transcriptional repressor of these genes. While there is a relatively large amount of knowledge about the genetics and molecular mechanisms that regulate the expression of genes involved in B. diazoefficiens nodulation, including the complete sequence of its genome, genetic information concerning B. elkanii is still relatively sparse, even if there are some available genomic data. In this study, genomic sequences of six strains of B. elkanii were compared with the genome of the reference strain B. diazoefficiens USDA 110 in order to elucidate mechanisms involved in the expression of nod genes, especially those related to the nod operon and the nod regulon. The results obtained allowed to add important aspects in the regulatory model presented to the reference strain and that could be extended to strains of B. elkanii.

A Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), processo no qual o nitrogênio atmosférico é convertido à amonia, é muito bem estabelecida entre bactérias diazotróficas coletivamente chamadas de rizóbios e espécies leguminosas. No Brasil, esse tipo de associação (simbiótica) supre totalmente a necessidade de nitrogênio na cultura da soja. Para que a infecção seja efetiva e possa resultar na formação de um nódulo capaz de sustentar o processo de FBN conduzido pelo bacterioide, o rizóbio necessita, previamente, reconhecer e responder à presença das raízes da planta compatível. As associações simbióticas entre rizóbios e plantas leguminosas são altamente específicas, de forma que cada espécie, ou até mesmo estirpe de rizóbio, possui uma gama definida de plantas às quais está apto a se associar, e vice-versa. A principal função dos produtos dos genes de nodulação (nod) é garantir a troca de sinais entre os dois organismos envolvidos na relação simbiótica, onde os produtos dos genes nod regulatórios atuam no controle da expressão de genes nod estruturais. A expressão de genes nod estruturais, via de regra, não ocorre de forma autônoma nos micro-organismos simbiontes do gênero Bradyrhizobium, requerendo assim a presença de moléculas sinalizadoras secretadas pelas raízes das plantas (predominantemente flavonoides) e ativadores transcricionais do tipo-LysR – as proteínas NodD regulatórias. Neste contexto, motivos específicos das proteínas NodD ligam-se a sequências conservadas na região promotora do operon nod, conhecidas como nod boxes, mediando a transcrição dos genes nod. Aparentemente, este sistema regulatório envolvendo as proteínas NodD está presente na maioria das estirpes de Rhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium, sugerindo um mecanismo geral de controle da nodulação. Em B. diazoefficiens, duas proteínas NodD foram identificadas, com funções e padrões de expressão distintos: NodD1, ativador da transcrição dos genes nod responsivo aos flavonoides liberados pelas raízes das plantas, e NodD2, com ação contrária, atuando como repressor da transcrição desses genes. Enquanto existe uma quantidade relativamente grande de conhecimento em relação à genética e aos mecanismos moleculares que regulam a expressão dos genes envolvidos na nodulação de B. diazoefficiens, incluindo a sequência completa de seu genoma, informações sobre a genética de B. elkanii ainda são relativamente escassas, mesmo que existam alguns dados genômicos disponíveis. Neste trabalho, sequências genômicas de seis linhagens de B. elkanii foram comparadas com o genoma da linhagem de referência B. diazoefficiens USDA 110 com o objetivo de elucidar mecanismos envolvidos na expressão dos genes nod, especialmente aqueles relacionados ao operon e ao regulon nod. Os resultados obtidos permitiram acrescentar aspectos importantes no modelo de regulação apresentado para a linhagem de referência e que pode ser estendido para linhagens de B. elkanii. / The Biological Nitrogen Fixation (BNF), process in which atmospheric nitrogen is converted to ammonia, is well established among diazotrophs collectively called rhizobia and legume species. In Brazil, this type of symbiotic association fully meets the need for nitrogen in soybean crop. To infection be effective and result in the formation of a nodule able to sustain the BNF process lead by the bacterioid, the rhizobia need previously to recognize and respond to the presence of the root of a compatible plant. The symbiotic associations between rhizobia and leguminous plants are highly specific, so that each species or even strain of rhizobia has a defined range of plants to which it is able to associate, and vice-versa. The main function of the products of nodulation (nod) genes is to guarantee the exchange of signals between the two organisms involved in the symbiotic relationship, where the products of regulatory nod genes act to control the expression of structural nod genes. The expression of structural nod genes usually does not occur independently in the symbiotic microorganisms of the Bradyrhizobium genus, thus requiring the presence of signalling molecules secreted by plant roots (predominantly flavonoids) and transcriptional activators – the LysR-type regulatory NodD proteins. In this context, NodD proteins bind to specific motifs of conserved sequences in the promoter region of the nod operon, known as nod boxes, mediating transcription of the nod genes. Apparently, this regulatory system involving NodD proteins is present in most strains of Rhizobium, Bradyrhizobium and Azorhizobium, suggesting a general mechanism of nodulation control. In B. diazoefficiens two NodD proteins were identified with distinct functions and expression patterns: NodD1, a flavonoid responsive transcriptional activator of nod genes, and NodD2 with counteraction, acting as a transcriptional repressor of these genes. While there is a relatively large amount of knowledge about the genetics and molecular mechanisms that regulate the expression of genes involved in B. diazoefficiens nodulation, including the complete sequence of its genome, genetic information concerning B. elkanii is still relatively sparse, even if there are some available genomic data. In this study, genomic sequences of six strains of B. elkanii were compared with the genome of the reference strain B. diazoefficiens USDA 110 in order to elucidate mechanisms involved in the expression of nod genes, especially those related to the nod operon and the nod regulon. The results obtained allowed to add important aspects in the regulatory model presented to the reference strain and that could be extended to strains of B. elkanii.

A Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), processo no qual o nitrogênio atmosférico é convertido à amonia, é muito bem estabelecida entre bactérias diazotróficas coletivamente chamadas de rizóbios e espécies leguminosas. No Brasil, esse tipo de associação (simbiótica) supre totalmente a necessidade de nitrogênio na cultura da soja. Para que a infecção seja efetiva e possa resultar na formação de um nódulo capaz de sustentar o processo de FBN conduzido pelo bacterioide, o rizóbio necessita, previamente, reconhecer e responder à presença das raízes da planta compatível. As associações simbióticas entre rizóbios e plantas leguminosas são altamente específicas, de forma que cada espécie, ou até mesmo estirpe de rizóbio, possui uma gama definida de plantas às quais está apto a se associar, e vice-versa. A principal função dos produtos dos genes de nodulação (nod) é garantir a troca de sinais entre os dois organismos envolvidos na relação simbiótica, onde os produtos dos genes nod regulatórios atuam no controle da expressão de genes nod estruturais. A expressão de genes nod estruturais, via de regra, não ocorre de forma autônoma nos micro-organismos simbiontes do gênero Bradyrhizobium, requerendo assim a presença de moléculas sinalizadoras secretadas pelas raízes das plantas (predominantemente flavonoides) e ativadores transcricionais do tipo-LysR – as proteínas NodD regulatórias. Neste contexto, motivos específicos das proteínas NodD ligam-se a sequências conservadas na região promotora do operon nod, conhecidas como nod boxes, mediando a transcrição dos genes nod. Aparentemente, este sistema regulatório envolvendo as proteínas NodD está presente na maioria das estirpes de Rhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium, sugerindo um mecanismo geral de controle da nodulação. Em B. diazoefficiens, duas proteínas NodD foram identificadas, com funções e padrões de expressão distintos: NodD1, ativador da transcrição dos genes nod responsivo aos flavonoides liberados pelas raízes das plantas, e NodD2, com ação contrária, atuando como repressor da transcrição desses genes. Enquanto existe uma quantidade relativamente grande de conhecimento em relação à genética e aos mecanismos moleculares que regulam a expressão dos genes envolvidos na nodulação de B. diazoefficiens, incluindo a sequência completa de seu genoma, informações sobre a genética de B. elkanii ainda são relativamente escassas, mesmo que existam alguns dados genômicos disponíveis. Neste trabalho, sequências genômicas de seis linhagens de B. elkanii foram comparadas com o genoma da linhagem de referência B. diazoefficiens USDA 110 com o objetivo de elucidar mecanismos envolvidos na expressão dos genes nod, especialmente aqueles relacionados ao operon e ao regulon nod. Os resultados obtidos permitiram acrescentar aspectos importantes no modelo de regulação apresentado para a linhagem de referência e que pode ser estendido para linhagens de B. elkanii. / The Biological Nitrogen Fixation (BNF), process in which atmospheric nitrogen is converted to ammonia, is well established among diazotrophs collectively called rhizobia and legume species. In Brazil, this type of symbiotic association fully meets the need for nitrogen in soybean crop. To infection be effective and result in the formation of a nodule able to sustain the BNF process lead by the bacterioid, the rhizobia need previously to recognize and respond to the presence of the root of a compatible plant. The symbiotic associations between rhizobia and leguminous plants are highly specific, so that each species or even strain of rhizobia has a defined range of plants to which it is able to associate, and vice-versa. The main function of the products of nodulation (nod) genes is to guarantee the exchange of signals between the two organisms involved in the symbiotic relationship, where the products of regulatory nod genes act to control the expression of structural nod genes. The expression of structural nod genes usually does not occur independently in the symbiotic microorganisms of the Bradyrhizobium genus, thus requiring the presence of signalling molecules secreted by plant roots (predominantly flavonoids) and transcriptional activators – the LysR-type regulatory NodD proteins. In this context, NodD proteins bind to specific motifs of conserved sequences in the promoter region of the nod operon, known as nod boxes, mediating transcription of the nod genes. Apparently, this regulatory system involving NodD proteins is present in most strains of Rhizobium, Bradyrhizobium and Azorhizobium, suggesting a general mechanism of nodulation control. In B. diazoefficiens two NodD proteins were identified with distinct functions and expression patterns: NodD1, a flavonoid responsive transcriptional activator of nod genes, and NodD2 with counteraction, acting as a transcriptional repressor of these genes. While there is a relatively large amount of knowledge about the genetics and molecular mechanisms that regulate the expression of genes involved in B. diazoefficiens nodulation, including the complete sequence of its genome, genetic information concerning B. elkanii is still relatively sparse, even if there are some available genomic data. In this study, genomic sequences of six strains of B. elkanii were compared with the genome of the reference strain B. diazoefficiens USDA 110 in order to elucidate mechanisms involved in the expression of nod genes, especially those related to the nod operon and the nod regulon. The results obtained allowed to add important aspects in the regulatory model presented to the reference strain and that could be extended to strains of B. elkanii.