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Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-09-14T13:40:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Ismael Fernandes.pdf: 2809362 bytes, checksum: d02368409d3300bdd35bf441997c2297 (MD5) / Approved for entry into archive by Edvaldo Souza (edvaldosouza@ufba.br) on 2017-10-02T20:28:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Ismael Fernandes.pdf: 2809362 bytes, checksum: d02368409d3300bdd35bf441997c2297 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-02T20:28:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final - Ismael Fernandes.pdf: 2809362 bytes, checksum: d02368409d3300bdd35bf441997c2297 (MD5) / capes / Surfactantes sintéticos ou tensoativos tornam-se um dos principais poluentes encontrados na natureza. Devido a vasta gama de utilização, são geralmente encontrados em efluentes urbanos bem como nos corpos hídricos receptores. A substituição desses tensoativo pelos biossurfactantes que apresentam características ambientalmente compatíveis tornou-se um tema relevante à pesquisa. O processo de produção dos biossurfactantes é o que inviabiliza sua produção em larga escala. Diversos estudos estão em desenvolvimento para descobrir novas fontes de carbono e energia que possibilitem um processo de produção mais barato. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a utilização da manipueira como fonte alternativa de carbono e energia para a produção de biossurfactante pelo microrganismo Paenibacillus sp. Parâmetros como o consumo de amido, produção de açúcares redutores e a variação da concentração de oxigênio no meio foram utilizados para acompanhar o crescimento bacteriano. Medição da tensão superficial, índice de emulsificação e diluição micelar crítica foram realizados para avaliar a presença de biossurfactante no meio de cultura. Adicionalmente, testes de estabilidade em função do pH, salinidade e temperatura foram realizados. Os resultados mostraram que a manipueira (agroresíduo da produção de farinha) poder ser utilizada como meio de crescimento bacteriano na produção de biossurfactante que apresenta propriedades tensoativas estáveis podendo ser utilizado em condições extremas de acidez, alcalinidade, salinidade e temperatura. A otimização e o escalonamento do processo de produção são importantes ferramentas no desenvolvimento de tecnologias ambientalmente amigáveis e economicamente viáveis para a produção de biossurfactantes com promissora aplicabilidade industrial.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis SBR5T é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, interessante modelo para o estudo da regulação da FBN com o genoma completo disponível. O fator de transcrição GlnR foi proposto como regulador dos genes nif em Paenibacillus spp. a partir de análises in silico. O presente trabalho identificou sítios de ligação de GlnR em promotores de genes envolvido com a FBN e validou o papel de GlnR como regulador negativo dos genes nif em P. riograndensis. Também foi demonstrado que a enzima glutamina sintetase interage com GlnR quando está inibida por feedback e estabiliza a ligação de GlnR às regiões reguladoras dos genes nif. Um modelo de repressão baseado em operadores múltiplos foi proposto integrando a regulação da FBN à regulação global do nitrogênio exercida por GlnR. Na tentativa de identificar elementos específicos relacionados à regulação do molibdênio (componente do cofator enzimático) e da nitrogenase alternativa (com cofator independente de molibdênio), foi acessado o perfil transcricional de P. riograndensis sob condições de limitação de nitrogênio e molibdênio. Alguns fatores de transcrição especificamente induzidos sob tais condições e provavelmente relacionados à homeostase de metais foram identificados. Com relação à glutamina sintetase, além da demonstração da interação entre a enzima e o fator de transcrição GlnR, duas proteínas adicionais homólogas de glutamina sintetase e que não participam dessa regulação foram identificadas codificadas no genoma. Uma delas foi caracterizada como glutamina sintetase funcional, enquanto a outra não apresentou atividade bioquímica. Além disso, um protocolo para transformação da linhagem em estudo foi estabelecido e otimizado, o que permitirá aprofundar os estudos de genética molecular tanto da FBN como de outros processos de interesse em P. riograndensis. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gram-negative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis SBR5T is a Grampositive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. The transcription factor GlnR has been proposed as the nif regulator in Paenibacillus spp. based on in silico analysis. The present work identified GlnR-binding sites at BNFrelated promoters and validated GlnR role as nif negative regulator in P. riograndensis. It was also demonstrated that the feedback-inhibited glutamine synthetase enzyme interacts with GlnR and stabilizes its binding activity in the nif genes promoters. A multiple operator model was proposed to integrate BNF regulation and the global nitrogen regulation coordinated by GlnR. In an effort to identify specific regulatory elements related to molybdenum (enzymatic cofactor component) and the alternative nitrogenase (which presents a molybdenum-independent cofactor), the transcriptional profile of P. riograndensis was accessed under nitrogen and molybdenum limiting conditions. Transcription factors specifically induced under such conditions and probably related to metal homeostasis were identified. Regarding the glutamine synthetase, two additional glutamine synthetase homologs that do not take part in GlnR regulation were identified. One of them was characterized as a functional glutamine synthetase, while the other did not display biochemical activity. Also, a protocol to transform the model in study was established and optimized. This protocol allows the development of further molecular research to unveil BNF and other interesting processes in P. riograndensis.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis SBR5T é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, interessante modelo para o estudo da regulação da FBN com o genoma completo disponível. O fator de transcrição GlnR foi proposto como regulador dos genes nif em Paenibacillus spp. a partir de análises in silico. O presente trabalho identificou sítios de ligação de GlnR em promotores de genes envolvido com a FBN e validou o papel de GlnR como regulador negativo dos genes nif em P. riograndensis. Também foi demonstrado que a enzima glutamina sintetase interage com GlnR quando está inibida por feedback e estabiliza a ligação de GlnR às regiões reguladoras dos genes nif. Um modelo de repressão baseado em operadores múltiplos foi proposto integrando a regulação da FBN à regulação global do nitrogênio exercida por GlnR. Na tentativa de identificar elementos específicos relacionados à regulação do molibdênio (componente do cofator enzimático) e da nitrogenase alternativa (com cofator independente de molibdênio), foi acessado o perfil transcricional de P. riograndensis sob condições de limitação de nitrogênio e molibdênio. Alguns fatores de transcrição especificamente induzidos sob tais condições e provavelmente relacionados à homeostase de metais foram identificados. Com relação à glutamina sintetase, além da demonstração da interação entre a enzima e o fator de transcrição GlnR, duas proteínas adicionais homólogas de glutamina sintetase e que não participam dessa regulação foram identificadas codificadas no genoma. Uma delas foi caracterizada como glutamina sintetase funcional, enquanto a outra não apresentou atividade bioquímica. Além disso, um protocolo para transformação da linhagem em estudo foi estabelecido e otimizado, o que permitirá aprofundar os estudos de genética molecular tanto da FBN como de outros processos de interesse em P. riograndensis. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gram-negative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis SBR5T is a Grampositive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. The transcription factor GlnR has been proposed as the nif regulator in Paenibacillus spp. based on in silico analysis. The present work identified GlnR-binding sites at BNFrelated promoters and validated GlnR role as nif negative regulator in P. riograndensis. It was also demonstrated that the feedback-inhibited glutamine synthetase enzyme interacts with GlnR and stabilizes its binding activity in the nif genes promoters. A multiple operator model was proposed to integrate BNF regulation and the global nitrogen regulation coordinated by GlnR. In an effort to identify specific regulatory elements related to molybdenum (enzymatic cofactor component) and the alternative nitrogenase (which presents a molybdenum-independent cofactor), the transcriptional profile of P. riograndensis was accessed under nitrogen and molybdenum limiting conditions. Transcription factors specifically induced under such conditions and probably related to metal homeostasis were identified. Regarding the glutamine synthetase, two additional glutamine synthetase homologs that do not take part in GlnR regulation were identified. One of them was characterized as a functional glutamine synthetase, while the other did not display biochemical activity. Also, a protocol to transform the model in study was established and optimized. This protocol allows the development of further molecular research to unveil BNF and other interesting processes in P. riograndensis.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis SBR5T é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, interessante modelo para o estudo da regulação da FBN com o genoma completo disponível. O fator de transcrição GlnR foi proposto como regulador dos genes nif em Paenibacillus spp. a partir de análises in silico. O presente trabalho identificou sítios de ligação de GlnR em promotores de genes envolvido com a FBN e validou o papel de GlnR como regulador negativo dos genes nif em P. riograndensis. Também foi demonstrado que a enzima glutamina sintetase interage com GlnR quando está inibida por feedback e estabiliza a ligação de GlnR às regiões reguladoras dos genes nif. Um modelo de repressão baseado em operadores múltiplos foi proposto integrando a regulação da FBN à regulação global do nitrogênio exercida por GlnR. Na tentativa de identificar elementos específicos relacionados à regulação do molibdênio (componente do cofator enzimático) e da nitrogenase alternativa (com cofator independente de molibdênio), foi acessado o perfil transcricional de P. riograndensis sob condições de limitação de nitrogênio e molibdênio. Alguns fatores de transcrição especificamente induzidos sob tais condições e provavelmente relacionados à homeostase de metais foram identificados. Com relação à glutamina sintetase, além da demonstração da interação entre a enzima e o fator de transcrição GlnR, duas proteínas adicionais homólogas de glutamina sintetase e que não participam dessa regulação foram identificadas codificadas no genoma. Uma delas foi caracterizada como glutamina sintetase funcional, enquanto a outra não apresentou atividade bioquímica. Além disso, um protocolo para transformação da linhagem em estudo foi estabelecido e otimizado, o que permitirá aprofundar os estudos de genética molecular tanto da FBN como de outros processos de interesse em P. riograndensis. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gram-negative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis SBR5T is a Grampositive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. The transcription factor GlnR has been proposed as the nif regulator in Paenibacillus spp. based on in silico analysis. The present work identified GlnR-binding sites at BNFrelated promoters and validated GlnR role as nif negative regulator in P. riograndensis. It was also demonstrated that the feedback-inhibited glutamine synthetase enzyme interacts with GlnR and stabilizes its binding activity in the nif genes promoters. A multiple operator model was proposed to integrate BNF regulation and the global nitrogen regulation coordinated by GlnR. In an effort to identify specific regulatory elements related to molybdenum (enzymatic cofactor component) and the alternative nitrogenase (which presents a molybdenum-independent cofactor), the transcriptional profile of P. riograndensis was accessed under nitrogen and molybdenum limiting conditions. Transcription factors specifically induced under such conditions and probably related to metal homeostasis were identified. Regarding the glutamine synthetase, two additional glutamine synthetase homologs that do not take part in GlnR regulation were identified. One of them was characterized as a functional glutamine synthetase, while the other did not display biochemical activity. Also, a protocol to transform the model in study was established and optimized. This protocol allows the development of further molecular research to unveil BNF and other interesting processes in P. riograndensis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-13T18:25:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 310324 bytes, checksum: e1520a589536ae039cea976d6ff67085 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-13T18:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 310324 bytes, checksum: e1520a589536ae039cea976d6ff67085 (MD5) Previous issue date: 2001-03-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A bactéria Paenibacillus amylolyticus, isolada de frutos de café que tiveram sua superfície devidamente desinfestada, foi cultivada em frascos Erlenmeyer de 125 mL, com 50 mL de volume de trabalho, em meio mineral suplementado com extrato de levedura 0,06% (p/v), com diferentes fontes de carbono, sempre a 0,3% (p/v) e pH 7,0, sendo a cultura incubada a 25 oC, com agitação de 150 rpm ou sem agitação. A bactéria também apresentou crescimento quando o extrato de levedura foi substituído por tiamina 50 mg L'1 e outras vitaminas do complexo B, mas nunca quando alguns desses fatores não eram adicionados ao meio mineral. Paenibacillus amylolyticus cresce na ausência de sulfato de amônio, desde que extrato de levedura 0,06% (p/v) esteja presente, porém o mesmo não se verifica quando se substitui o extrato de levedura por tiamina 50 mg L'l. O microrganismo não foi capaz de crescer em anaerobiose provocada pelo borbulhamento de nitrogênio gasoso, tanto na presença quanto na ausência de sulfato de amônio, indicando que tal bactéria não é capaz de crescer em anaerobiose e fixar nitrogênio nessa condição. P. amylolyticus é capaz de crescer em pectina como única fonte de carbono e, para tal, produz pectina liase (PL), para lise deste carboidrato. A enzima PL acumula- se no meio mais eficientemente após 24 horas de crescimento, apresentando maior especificidade por pectina cítrica, quando utilizada como substrato enzimático. A atividade ótima de PL ocorre a 40 ºC e a termoestabilidade, até 45 ºC. Entre os valores de pH avaliados, PL apresentou atividade entre pH 5,6 e 8,6, sendo o ótimo 7,9. A adição de EDTA e íons metálicos na mistura de reação mostrou pequeno efeito na atividade da enzima, e os valores de Km e Vmax aparentes foram, respectivamente, de 6,61 mg mL'1 e 1,24 X 10'7 mol min 4 mL'l. / The bacterium Paenibacillus amylolyticus, isolated from surface- sterilized coffee beans, was cultured at 25 oC, with and without agitation, in 125 mL shaker flasks containing 50 mL of mineral media (pH 7.0) supplemented with yeast extract 0.06% (w/v) and different carbon sources at a concentration of 03% (w/v). P. amylolyticus also showed growth when yeast extract was replaced with thiamin 50 mg L'1 and other B complex Vitamins, but no growth was detected when one of these substances was not added to the media. This bacterium grows in absence of ammonium sulfate when yeast extract 0.06% (w/v) is added, although growth is not detected when yeast extract is replaced with thiamin 50 mg L'l. When submitted to na anaerobic environment, through of addition of gas nitrogen, no growth was verified in a medium with and without fixed nitrogen, indicating that this organism is not capable of fixing gas nitrogen. P. amylolyticus is capable of using pectin as a sole carbon source, a result that indicates production of pectin liase (PL). The production of this enzyme is detected in higher concentrations after 24 hours of growth, showing an increased affinity, or specificity , for citn'c pectin when this is used as the enzymatic substrate. Optimum activity for PL occurs at 40oC and is thermostable for up to 45 oC. PL shows activity between pH values of 5.6 and 8.6, although pH 7.9 is best. Addition of EDTA and metal ions to the reaction mixture present a small effect in enzyme activity, and the Km and Vmax values are 6.61 mg mL'1 and 1.24 x 10"7 mol min"l mL'l, respectively. / Dissertação importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6472.pdf: 2357652 bytes, checksum: b48a2e541ddf343b775996e49d4e7f1f (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides that show the ability to encapsulate a large number of organic molecules at the molecular level. Thus, they have large application in pharmaceutical, food, and cosmetics industries. CDs may have different sizes; however the most common are formed by 6, 7, and 8 glucose units, called α, β and γ-CD, respectively. These compounds are produced from starch by hydrolysis catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase ( CGTase - EC 2.4.1.19 ) enzyme. CGTase is commonly produced from bacteria of the genus Bacillus and Klebsiella pneumoniae. Due to the commercial importance of this enzyme and of the microorganisms producing CGTase whose enzyme is capable to produce only one CD, this work aimed to evaluate the CGTase production by the bacterium Paenibacillus sp. F37. The experiments aimed to assess the potential for enzyme production by Paenibacillus sp. F37 strain and also the characterization and classification of the enzyme. Analysis of enzymatic activity was accomplished by cyclization activity of the supernatant of the culture medium, which was monitored by the production rate of β-CD at 50°C, pH 8.0 using a solution of dextrin as substrate. Initially it was evaluated the effect of the pH (6.0 to 10.0) over the microorganism growth into solid Horikoshi medium without starch. It was observed that the microorganism grew better at pH 8.0, being this pH adopted for assays using liquid Horikoshi medium without starch. In this step it was established the following conditions to the bacterium growth: 10h, 37oC, and agitation of 120 rpm in an incubator. The CGTase production step was performed into Horikoshi medium containing 1% (m/v) soluble starch (enzyme inducer), and pH and production time were evaluated. Under standard conditions (37oC, 120 rpm, 16h, and culture medium prepared in 0.1 M tris-HCl buffer pH 9.0) the volumetric activity from the culture medium achieved about 800 U/L, corresponding to a productivity of 50 U/L.h-1. The characterization of the crude enzyme showed that the CGTase from Paenibacillus sp. F37 strain has maximum cyclization activity around 50oC and pH 6.0. Under these conditions the enzyme showed to have a half-life time around 2 h. At the growth conditions (37oC, pH 9.0), the enzyme show to have a half-life time around 3h, being almost inactivated around 5h. Thus, the enzyme production in a medium where pH starts at 9.0 and is decreased to around 6.0 during the growth showed to be a good strategy to prevent denaturation of the enzyme. The CD production into batch reactor and their characterization by colorimetric and chromatographic methods allowed classifying the enzyme as a β-CGTase (ratio α-:β-:γ-CD of 0:1:0.26). At the CD-production conditions (50oC, pH 8.0, 50 g/L of dextrin, 1.6 U/g of dextrin, and 92 h) it was achieved β-CD productivity around 100 mg/L.h. These results showed that Paenibacillus sp. F37 strain is a promising microorganism for producing CGTase. / Ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos de grande importância comercial e que apresentam amplo emprego industrial nos setores farmacêutico, alimentício, de cosmético, dentre outros, por terem a capacidade de encapsulamento ao nível molecular de um grande número de moléculas orgânicas. CDs podem apresentar diversos tamanhos, sendo as que têm 6, 7 ou 8 unidades de glicose, denominadas α, β e γ-CD, respectivamente, são as mais conhecidas. Estas são obtidas a partir da hidrólise do amido pela ação da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase EC 2.4.1.19). A CGTase geralmente é produzida por bactérias do gênero Bacillus e Klebsiella pneumoniae. Levando em consideração a importância comercial desta enzima e a busca por microrganismos produtores de CGTase que produzam predominantemente uma CD de interesse, esse trabalho buscou avaliar a produção de CGTase a partir de Paenibacillus sp. F37. Os experimentos tiveram como objetivo a avaliação do potencial de produção da enzima por esse microrganismo, bem como a caracterização e a classificação da enzima. A análise de atividade enzimática foi realizada pela atividade de ciclização do sobrenadante do meio de cultivo, que foi monitorada pela taxa de produção de β−CD a 50°C, pH 8,0, usando uma solução de dextrina como substrato. Avaliou-se inicialmente a influência do pH (6,0 a 10,0) no crescimento do microrganismo em meio Horikoshi sólido, sem amido. Observou-se melhor crescimento em pH 8,0, definindo-se esse valor para ensaios de crescimento em meio Horikoshi líquido, sem amido. Nessa etapa definiram-se as condições de crescimento como 10 h, 37ºC e agitação de 120 rpm em câmara incubadora. A etapa de produção da CGTase foi realizada em meio Horikoshi com amido solúvel 1%, m/v (indutor da enzima), avaliando-se pH e tempo de cultivo. Sob condições padronizadas (37ºC, 120 rpm, 16 h e meio de produção preparado em tampão tris-HCl 0,1 M, pH 9,0) atingiu-se uma atividade volumétrica no meio de produção da ordem de 800 U/L, correspondendo a uma produtividade de aproximadamente 50 U/L.h-1. A caracterização da enzima bruta mostrou que a CGTase de Paenibacillus sp. F37 apresenta atividade máxima de ciclização em 50ºC, pH 6,0. Nessas condições a enzima apresentou meia-vida aproximada de 2 h. Nas condições de cultivo (37ºC, pH 9,0), a enzima apresentou baixa estabilidade, com meia-vida em torno de 3 h, sendo praticamente inativada em 5 h. Por isso, produzir a enzima em meio cujo pH inicial é 9,0 e esse reduz-se ao longo do cultivo para em torno de 6,0, mostrou-se uma boa estratégia para prevenir a desnaturação da enzima. A produção de CDs em reator batelada e a sua caracterização colorimétrica e por CLAE permitiram a classificação da enzima como uma β-CGTase (razão α-:β-:γ-CD de 0:1:0,26). Nas condições de produção de CDs (50ºC, pH 8,0, 50 g/L de dextrina, 1,6 U/g de dextrina e 92 h) atingiu-se uma produtividade de β-CD da ordem de 100 mg/L.h. Os resultados indicam, portanto, que Paenibacillus sp. F37 é um microrganismo promissor na produção de CGTase.