PINTO, A. C. M. D. Efeito anti-inflamatório e imunomodulador de componentes de ascaris suum em artrite
experimental, 2017.118 f.Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017 / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-07-21T13:27:56Z
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Previous issue date: 2017-07-10 / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune inflammatory disease with multifactorial
etiopathogenesis, involving genetic, immunological and environmental mechanisms, whose
diagnosis and delayed treatment have a negative influence on the prevalence and severity of
the disease. Therefore, patients residing in low-income countries should show increased
morbidity and / or mortality from these diseases. Interestingly, the evolution seems to be
similar, if not less severe, to that found in populations with better socioeconomic indexes. The
hygienic hypothesis suggests an inverse relationship between the global distribution of
autoimmune diseases and parasitic infections, where helminths tend to stimulate the
development of Th2 responses and suppress Th-1 and Th-17 responses. The aim of this study
was to isolate components in Ascaris suum extract and characterize its anti-inflammatory
mechanism in experimental arthritis models. Ascaris suum crude extract was separated into
fractions > 30 and <30 kDa. Four smaller fractions (1-4) were obtained, in the fraction <30
kDa, by native electrophoresis. In fraction 1, the ABA-1 protein was identified by mass
spectrometry and after protein digestion with trypsin, seven peptides were isolated (Aba-AG).
The genomic sequence of the Aba-B and Aba-F peptides was inserted into a commercial
plasmid (VR2 -001-TOPO ™). Plasmids were cloned and expanded in E. coli and extraction
of plasmid DNA was performed by commercial kit (Qiagen ™). Male Swiss mice received
crude extract of A. suum (1mg), > 30kDa, <30kDa (50ng) or fractions 1, 2, 3 and 4 (1μL),
diluted in sterile saline (200 μL), p.o., 30min before of the injection of Zy (0.1mg) i.a.
Hypernociception was evaluated by the electronic von Frey and the cellular influx was
evaluated in the joint fluid 6h or seven days after zymosan i.a. Swiss and Balb/c male mice,
submitted to ZyA and AIA, respectively, received recombinant plasmids of Aba-B or Aba-F
(50μg/30μL) at the back of each hind leg. The cell influx was evaluated 6h or seven days
(ZyA) and 7h or 14 days (AIA) after the i.a stimulus. Cytokines were evaluated in the
synovial fluid. Synovitis and joint damage were evaluated by H&E and safranin O,
respectively, and mast cell by toluidine blue. Levels of cytokines (CXCL-1, IL-1β, IFN-γ, IL-
5, IL-6 and IL-10) were assessed by ELISA and the expression of iNOS, CD11b, F4/80 and
CD206 by immunohistochemistry. The administration of fractions <30 kDa, 1 and 4 reduced
hypernociception and acute and chronic cellular influx in the ZyA model. Transfection with
both plasmids, Aba-B or F, significantly reduced the influx of cells in both the zymosan and
acute and chronic mBSA arthritis models. Reduction of synovitis, mast cell numbers, joint
damage and iNOS expression were observed. Levels of CXCL1, IFN-γ, IL-1β and IL-6 were
reduced. However, IL-10 levels did not increase. Surprisingly, IL-5 levels were significantly
reduced after plasmid injection. Plasmids increased the expression of M2 macrophages in the
synovium. A qPCR analysis showed the expression of peptides in the thigh muscles of mice
that received the plasmids. This is the first demonstration that peptide sequences derived from
A. suum promote anti-inflammatory activity in arthritis models, and that it is associated with
reduced release of inflammatory cytokines. Peptides promoted a change in the differentiation
of macrophages in the synovial membrane at the same time, decreasing the release of IL-5.
Despite the complex modulating mechanisms of helminths of inflammation, the data still
support a protective effect of helminth products in chronic arthritis. / A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória autoimune crônica com etiopatogenia
multifatorial, envolvendo mecanismos genéticos, imunológicos e ambientais, cujo diagnóstico
e tratamento tardio influenciam negativamente na prevalência e gravidade da doença.
Portanto, pacientes que residem em países com baixa renda deveriam apresentar um aumento
da morbidade e / ou mortalidade por essas doenças. Curiosamente, a evolução parece ser
semelhante, se não menos grave, à encontrada em populações com melhores índices
socioeconômicos. A hipótese higiênica sugere relação inversa entre a distribuição global de
doenças autoimunes e infecções parasitárias, onde helmintos tendem a estimular o
desenvolvimento de respostas Th2, além de suprimir respostas Th-1 e Th-17. O objetivo deste
estudo foi isolar componentes no extrato de Ascaris suum e caracterizar seu mecanismo antiinflamatório
em modelos de artrite experimental. O extrato bruto de Ascaris suum foi
separado em frações > 30 e <30 kDa. Foram obtidas quatro frações menores (1-4), na fração
<30 kDa, por eletroforese nativa. Na fração 1, foi identificada a proteína ABA-1, por
espectrometria de massa, e após digestão proteica com tripsina, sete peptídeos foram isolados
(Aba-A – G). A sequência genômica dos peptídeos de Aba-B e Aba-F foi inserida em um
plasmídeo comercial (VR2-001-TOPO ™). Os plasmídeos foram clonados e expandidos em
E. coli e a extração do DNA plasmidial foi realizada por kit comercial (Qiagen™).
Camundongos Swiss machos receberam extrato bruto de A. suum (1mg), >30 kDa , <30kDa
(50ng) ou frações 1, 2, 3 e 4 (1μL), diluídos em salina estéril (200 μL), v.o., 30 min antes da
injeção de Zy (0,1mg) i.a. Hipernocicepção foi avaliada pelo von Frey eletrônico e o influxo
celular foi avaliado no fluido articular 6h ou sete dias após zymosan i.a. Camundongos Swiss
e Balb/c machos, submetidos a artrite induzida por zymosan AZy e induzida por antígeno
(AIA), respectivamente, receberam plasmídeos recombinantes de Aba-B ou Aba-F
(50μg/30μL) na parte posterior de cada coxa traseira. O influxo celular foi avaliado 6h ou sete
dias (AZy) e 7h ou 14 dias (AIA) após o estímulo i.a. Citocinas foram avaliadas no líquido
sinovial. Sinovite e dano articular foram avaliados por H&E e safranina O, respectivamente, e
número de mastócitos por azul de toluidina. Níveis de citocinas (CXCL-1, IL-1β, IFN-γ, IL-5,
IL-6 e IL-10) foram avaliadaos por ELISA e a expressão de iNOS, CD11b, F4/80 e CD206
por imunohistoquímica. A administração das frações <30 kDa, 1 e 4 reduziu a
hipernocicepção e influxo celular agudo e crônico no modelo de AZy. A transfecção com
ambos os plasmídeos, Aba-B ou F, reduziu significativamente o influxo de células em ambos
os modelos de artrite por zymosan e mBSA agudo e crônico. Foram observados a redução da
sinovite, número de mastócitos, do dano articular e expressão de iNOS. Níveis de CXCL1,
IFN-γ, IL-1β e IL-6 foram reduzidos. No entanto, os níveis de IL-10 não aumentaram.
Surpreendentemente, os níveis de IL-5 foram significativamente reduzidos após a injeção de
plasmídeos. Plasmídeos aumentaram a expressão de macrófagos M2 na sinóvia. Uma análise
quantitativa por PCR mostrou a expressão de peptídeos Aba-B e Aba-F nos músculos da coxa
de camundongos que receberam os plasmídeos. Esta é a primeira demonstração de que
sequências peptídicas derivadas de A. suum promovem a atividade anti-inflamatória em
modelos de artrite, e que está associada à redução da liberação de citocinas inflamatórias.
Esses peptídeos promoveram mudança na diferenciação de macrófagos na membrana sinovial
ao mesmo tempo, diminuindo a liberação de IL-5. Apesar dos complexos mecanismos de
modulação de helmintos de inflamação, os dados suportam ainda um efeito protetor dos
produtos de helmintos em modelos de artrite crônica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/24185 |
| Date | 10 July 2017 |
| Creators | Pinto, Ana Carolina Matias Dinelly |
| Contributors | Rocha, Francisco Airton Castro |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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