FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / nÃo hà / Soyatoxina 2 (SYTX-2) à uma proteÃna tÃxica isolada de sementes de soja [Glycine max (L.) Merril], genÃtipo BR-10, sendo letal para camundongos quando administrada por via intraperitoneal (DL50 4,5  0,1 mg/Kg de peso corpÃreo). Os sintomas observados apÃs sua administraÃÃo foram piloereÃÃo, taquicardia, estiramento de patas e da cauda, diurese e convulsÃes tÃnico-clÃnicas, que precederam a morte do animal. A SYTX-2 foi purificada do extrato bruto de soja por fracionamento com sulfato de amÃnio, cromatografias de troca iÃnica (DEAE-celulose), de afinidade (Sepharose-4B-tripsina) e de filtraÃÃo em gel (Superdex 200HR 10/30). A inclusÃo de ditiotreitol 0,005 M no tampÃo de extraÃÃo e em outros tampÃes utilizados durante o processo de purificaÃÃo foi crucial para obtenÃÃo da SYTX-2 num estado altamente homogÃneo e preservaÃÃo da toxicidade. A SYTX-2 nÃo à uma glicoproteÃna e apresenta massa molecular aparente de 28,0 e 25,4 kDa, quando avaliada por PAGE-SDS e filtraÃÃo em gel em coluna de Superdex 200HR 10/30, respectivamente, e coeficiente de extinÃÃo molar (ε1%1cm) de 16,9. Sua seqÃÃncia NH2-terminal exibiu uma identidade de 75%, quando relacionada com aquela de uma endoquitinase acÃdica da classe III de sementes de soja. Ao lado de sua atividade tÃxica, a SYTX-2 apresentou atividade quitinÃsica de 1,34 nKat/mgP. Essa toxina, quando em contato com o nervo ciÃtico de ratos foi capaz de aumentar a amplitude pico-a-pico, comprovando sua aÃÃo neurotÃxica. A SYTX-2 tambÃm mostrou atividade prÃ-inflamatÃria, induzindo migraÃÃo de neutrÃfilos para a cavidade peritoneal de ratos, cujo pico se deu 8 h apÃs sua administraÃÃo. AvaliaÃÃo de seu papel fisiolÃgico, mostrou que a SYTX-2 exerceu efeitos negativos sobre o desenvolvimento do inseto-peste de feijÃo-de-corda Callosobruchus maculatus, particularmente na emergÃncia do adulto e no tempo mÃdio de desenvolvimento larval. Adicionalmente, SYTX-2 foi tÃxica para ninfas de Dysdercus peruvianus, causando reduÃÃo no ganho de peso corpÃreo e na taxa de sobrevivÃncia. A SYTX-2 tambÃm atuou negativamente sobre o nematÃide Meloidogyne incognita, impedindo sua mobilidade. Por outro lado, a SYTX-2 nÃo foi capaz de inibir a germinaÃÃo de esporos e nem o desenvolvimento de hifas dos fungos Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum e Aspergillus niger, nas condiÃÃes de ensaio realizadas no presente trabalho. Em resumo, este trabalho apresenta, pela primeira vez, dados de uma proteÃna neurotÃxica contendo uma atividade quitinÃsica nÃo usual, cujo papel parece estar relacionado aos mecanismos de defesa da planta. Nesse contexto, SYTX-2 possui potencial para aplicaÃÃo biotecnolÃgica como um novo agente de defesa vegetal contra insetos-peste e nematÃide-parasitas / Soyatoxin 2 (SYTX-2) is a toxic protein isolated from soybean seeds [Glycine max (L.) Merril], genotype BR-10, lethal to mice upon intraperitoneal injection (LD50 4.5  0.1 mg/Kg body weight). The symptoms observed upon administration were pilloerection, tachycardia, paw and tail extending, diuresis and tonic-clonic convulsions prior to death. The SYTX-2 was purified from soybean crude extract by ammonium sulfate fractionation, ion-exchange (DEAE-cellulose), affinity (Sepharose-4B-trypsin) and gel filtration (Superdex 200HR 10/30) chromatography. Inclusion of 0.005 M dithiothreitol in the extracting and other buffers used during the purification process was crucial to
obtain highly homogenous SYTX-2 and to preserve the toxicity. SYTX-2 is not a glycoprotein and has apparent molecular masses of 28.0 and 25.4 kDa as measured by SDS-PAGE and gel filtration in Superdex 200HR 10/30 column,
respectively, and a molar extinction coefficient (ε1% 1cm) of 16.9. Its NH2-terminal sequence shows 75% identity with a class III acidic endochitinase from soybean seeds. Therefore, besides to its toxic properties, SYTX-2 presented chitinase activity of 1.34 nKat/mgP. This toxin, when in contact with the sciatic nerve of rats was able to increase the peak-to-peak amplitude, confirming its neurotoxic action. Moreover, SYTX-2 presented pro-inflammatory activity, inducing neutrophil migration into the peritoneal cavity of rats which peaked at 8 h after administration. Evaluation of its physiological role showed that SYTX-2 exerted negative effect on the development of the cowpea pest insect Callosobruchus maculates, particularly on adult emergence and in the mean larval development time. Additionally, SYTX-2 was toxic to Dysdercus peruvianus nymphs, as it caused reduction of both the body weight gain and survival rate. SYTX-2 also acted negatively on the root-knot nematode Meloidogyne incognita by hindering its mobility. On the other hand, SYTX-2 did not inhibit neither the spore germination nor the hyphal development of the phytopathogenic fungi Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum and Aspergillus niger, under the assay conditions carried out in this present work. In summary this study presents, for the first time, data on a neurotoxin protein with additional unusual chitinase activity, whose physiological role is likely related to the plant defense mechanisms. Accordingly, SYTX-2 possesses potential biotechnological application as a novel plant defensive agent against insect pests and parasitic nematodes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:1827 |
| Date | 28 April 2006 |
| Creators | Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa |
| Contributors | Ilka Maria Vasconcelos, Nylane Maria Nunes de Alencar, Ana Cristina de Oliveira Monteiro Moreira, Thalles Barbosa Grangeiro, MaurÃcio Pereira de Sales |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em BioquÃmica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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