CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarÃdeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que à extremamente abundante na natureza. ApÃs o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteÃnas com potencial biotecnolÃgico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteÃna CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em cÃlulas de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importÃncia mÃdica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteÃna truncada, sem um possÃvel peptÃdeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressÃo pPICZαA, para expressÃo em P. pastoris KM71H. A proteÃna completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fraÃÃo proteica, contendo as proteÃnas secretadas para o meio de cultura, por cÃlulas de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressÃo recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogÃnea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo trÃs bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoÃcidos. ApÃs coloraÃÃo com reagente de Schiff para revelaÃÃo de glicoproteÃnas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. AlÃm disso, rCV2736PS+ teve seus peptÃdeos identificados por espectrometria de massas, na fraÃÃo F0/95 do meio de cultura livre de cÃlulas. A proteÃna recombinante produzida sem os 22 aminoÃcidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinÃsica maior que a encontrada para a fraÃÃo contendo rCV2736PS+, apesar de nÃo ter sido detectada por SDS-PAGE. A fraÃÃo F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestÃvel atà 50ÂC e com pico de atividade quitinolÃtica em pH 3,0. A mesma fraÃÃo apresentou maior atividade endoquitinÃsica e ativa contra os substratos sintÃticos 4-nitrofenil N,Nââdiacetil-β-D-quitobiosÃdeo e 4-nitrofenil N,Nâ,Nâââtriacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), tÃpico das proteÃnas da famÃlia GH18. Do mesmo modo, a fraÃÃo F0/95 foi testada contra seis espÃcies de bactÃrias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fraÃÃo foi testada contra a levedura Candida albicans, mas nÃo foi detectada inibiÃÃo do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteÃna recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molÃcula com potencial antibacteriano.
Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; ExpressÃo heterÃloga. / Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a
polysaccharide composed of units of N-acetyl-D-
glucosamine, which is abundant in nature.
The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472
has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism
of medical importance. To this purpose, the full ORF
(encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ
α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736
PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41.
3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiffâs reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed
higher chitinase activity than that found for th
e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium
of induced cells, was active after heat treatment at
50 ÂC and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to
degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl
-β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet
yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated
that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8
barrel (also known as TIM barrel), which is typical of
the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same
fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition
of this microorganism in the assay. These results
suggest that rCV2736 should be further studied as a new
anti-bacterial agent.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:5936 |
| Date | 24 August 2012 |
| Creators | Suelen Carneiro de Medeiros |
| Contributors | Thalles Barbosa Grangeiro, Nadia Accioly Pinto Nogueira, Maria Izabel Florindo Guedes |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em BioquÃmica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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