Les réticences de la société à l'égard de l'utilisation pharmaceutique de protéines purifiées à partir de sources potentiellement porteuses d'agents pathogènes ont contribué à l'émergence d'une nouvelle approche pour l'expression hétérologue des protéines, baptisée "moléculture végétale" (de l'anglais : molecular farming). Prometteuse à plusieurs égards, cette nouvelle discipline a attiré l'attention de plusieurs équipes de recherche en biotechnologie végétale, qui se sont aussi penchées, depuis quelques années, sur les limites associées à cette approche. En dépit des avantages évidents associés à la production des protéines recombinantes dans les tissus végétaux, l'activité biologique de la protéine recombinante et les mécanismes de protection endogène de la cellule hôte contre les protéines étrangères [la reconnaissance du non-soi] constituent, notamment, des contraintes souvent importantes pour la production efficace de protéines in planta. L'expression de certaines protéines recombinantes chez les plantes pourrait par exemple, en théorie, interrompre des interactions protéine-protéine spécifiques ou créer des réactions métaboliques indésirables en altérant des processus biochimiques ou des sentiers métaboliques essentiels au bon fonctionnement de la cellule hôte. Dans le but de mieux comprendre l'impact de l'expression des protéines recombinantes chez les plantes, le présent projet visait à étudier l'effet de la compartimentation cellulaire sur l'intégrité structurale et l'activité biologique in planta d'un inhibiteur de protéases à large spectre d'action, l'aprotinine bovine, exprimé chez la pomme de terre, Solanwn tuberosum L. Des lignées de pomme de terre accumulant l'aprotinine dans trois compartiments cellulaires - le cytosol, le réticulum endoplasmique (RE) et le milieu extracellulaire - ont d'abord été développées, après quoi le niveau d'expression du transgène et le taux d'accumulation de la protéine ont été déterminés par des procédures courantes de PCR en temps réel et d'immunodétection sur membrane solide. Une nouvelle technique pour la détection, la quantification et la caractérisation des protéines a ensuite été développée pour l'étude de la protéine recombinante exprimée, basée sur l'emploi conjoint de biopuces à protéines et d'un spectromètre de masse, le système SELDI-TOF/MS. Afin de cerner l'impact métabolique possible de la protéine recombinante sur la plante hôte, des analyses protéomiques basées sur l'électrophorèse bidimensionnelle, l'analyse d'images et la spectrométrie de masse ont finalement été réalisées afin de détecter et d'identifier, le cas échéant, les composantes du protéome endogène éventuellement modulées dans la plante modifiée. La rapidité et la précision de l'approche de détection des protéines par SELDITOF/MS font de la nouvelle approche d'analyse une technique prometteuse dans le domaine de la moléculture, utile pour l'étude préliminaire rapide des formes protéiques accumulées. En bref, cette approche nous a permis de détecter trois formes tronquées d'aprotinine bovine chez les plantes dirigeant cette protéine dans le RE, démontrant que la stabilité des protéines recombinantes dans ce compartiment cellulaire n'est pas universelle, à l'inverse des théories courantes. Malgré l'absence d'effet notable de l'inhibiteur recombinant sur la croissance et la morphologie des clones produits, des analyses protéomiques- subséquentes ont révélé, par ailleurs, que plusieurs protéines montrant une teneur altérée chez ces clones étaient impliquées dans la synthèse et la maturation des protéines endogènes au niveau cellulaire, suggérant un effet d'interférence de l'aprotinine sur la synthèse protéique cellulaire et expliquant possiblement une baisse significative de la teneur en protéines foliaires totales observée chez les mêmes clones. En dépit d'un taux d'accumulation plus faible chez les clones accumulant l'inhibiteur dans le milieu extracellulaire, ce dernier compartiment s'est avéré mieux adapté à l'accumulation d'aprotinine, générant une protéine entière et non tronquée montrant peu d'effets sur le métabolisme générale de la plante hôte. Ces résultats, qui illustrent la complexité des interactions moléculaires et cellulaires pouvant survenir in planta entre une protéine recombinante et la plante hôte, mettent aussi en évidence l'importance d'études empiriques détaillées sur l'impact des signaux d'adressage ajoutés aux constructions génétiques développées à des fins de moléculture.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/18558 |
| Date | 11 April 2018 |
| Creators | Badri, Mohamed Amine |
| Contributors | Michaud, Dominique |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | xi, 106, [2] f., application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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