Malgré les progrès récents associés à l’utilisation des nucléases d’ingénierie du génome, certaines problématiques persistent. Par exemple, l’isolement des cellules génétiquement modifiées est un travail long et parfois laborieux. De plus, la spécificité des nucléases est aussi un point souvent mal caractérisé. Cette dernière peut avoir des conséquences importantes in vitro, mais particulièrement in vivo. Le but de mon projet de maitrise était de développer des techniques permettant d’adresser ces deux problématiques. Ici, nous avons créé une cassette de sélection auto-excisable qui exploite le processus de réparation par appariement simple brin (SSA) et qui permet une isolation simple de clones modifiés sans laisser de « cicatrices » dans l’ADN. Le procédé se base sur une sélection à la puromycine, une contre sélection au ganciclovir et une excision de la cassette de résistance via l’utilisation de nucléases thermosensibles. Nous avons démontré la faisabilité de cette approche en intégrant la protéine fluorescente EGFP au locus AAVS1 et en insérant une étiquette de purification au locus EZH2. Ce locus code la protéine Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Dans un deuxième temps, nous avons évalué la possibilité d’utiliser deux paires de nickases pour créer deux cassures simple brin (SSB) et ainsi induire indirectement une cassure double brin dans l’ADN. Cette approche permet de diminuer de façon importante la possibilité de créer des mutations à des sites non-ciblés. Nous avons déterminé que deux SSBs doivent avoir lieu sur des brins opposés et à proximité afin de stimuler la modification génique voulue. Toutefois, ces paires de nickases ont une efficacité plus faible que les nucléases clivant au même endroit. Les nouveaux outils décrits dans ce mémoire permettront éventuellement de simplifier l’ingénierie du génome en diminuant la charge de travail nécessaire à l’enrichissement des cellules modifiées génétiquement et en augmentant la spécificité des nucléases, ce qui permet de réduire les probabilités de mutations à des loci hors cible. / Despite recent advances in the use of engineered nucleases, some issues remain. For example, isolation of genetically engineered cells is a long and sometimes laborious process. Moreover, the specificity of nucleases is often poorly characterized. The latter may have important consequences in vitro, but particularly in vivo. We aimed to develop techniques for addressing these two problems. Here we have created a self-excisable selection cassette that exploits the single-strand annealing (SSA) repair process and allows for simple isolation of modified clones and scarless genome editing. The method is based on puromycin selection, ganciclovir counter-selection and excision of the resistance cassette via the use of heat-sensitive nucleases. We demonstrate the feasibility of this approach by integrating the fluorescent protein EGFP at the AAVS1 locus and by inserting a purification tag at the EZH2 locus. This locus encodes the protein Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2). Secondly, we evaluated the possibility of using two pairs of nickases to create two single-strand breaks that could be repaired as a double strand break. As a proof of concept, we created two single-strand breaks at a distance of 513 bp at the CCR5 locus. When they take place on opposite strands, the latter can recreate the effect of a double-strand break, but with a lower efficiency than the nucleases cleaving at the same site. We determined that the double-strand break effect created by two single-strand breaks increases as the distance between the two single-strand breaks decreases. The new tools described here make it possible to simplify genome engineering by reducing the workload necessary for the enrichment of genetically modified cells and by increasing the specificity of the nucleases by decreasing the potential for off-target mutagenesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/28262 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Raymond Fleury, Alexandre |
| Contributors | Doyon, Yannick |
| Publisher | Université Laval |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 1 ressource en ligne (xv, 92 pages), application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, https://corpus.ulaval.ca/jspui/conditions.jsp |
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