Doctor en Farmacología / El alcoholismo es una de las adicciones de mayor prevalencia en el mundo. Sin
embargo, se ha visto que la presencia de ciertos polimorfismos en los genes de las
enzimas que metabolizan el etanol, son capaces de proteger a sus portadores de
desarrollar esta enfermedad. En humanos el etanol es metabolizado principalmente en
el hígado por la deshidrogenasa alcohólica (ADH) generando acetaldehído, metabolito
que es oxidado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). En
algunos individuos de la población asiática, una mutación puntual en el gen de la
ALDH2 (ALDH2*2) elimina la actividad de esta enzima, lo que produce una gran
acumulación de acetaldehído en la sangre luego del consumo de bebidas alcohólicas.
Este aumento de los niveles sanguíneos de acetaldehído genera marcados efectos
disfóricos que provocan un rechazo al consumo de alcohol. Por otra parte, los
individuos que poseen una variante rápida de la ADH (ADH1B*2; 47His) presentan
también una marcada protección contra el alcoholismo respecto a portadores de la
enzima normal (ADH1B*1; 47Arg). A pesar de que la enzima rápida ADH1B*2 tiene
una Vmax 100 veces mayor que la enzima normal ADH1B*1, los individuos portadores
del alelo ADH1B*2 no presentan una mayor velocidad de eliminación del etanol y
tampoco niveles aumentados de acetaldehído (medidos en sangre venosa) que
expliquen su protección al alcoholismo.
En esta tesis se desarrolló un modelo animal en ratas bebedoras de alcohol que, al
expresar una ADH de elevada actividad por entrega génica, podría ayudar a entender
los mecanismos involucrados en la protección al alcoholismo observada en portadores
de la enzima rápida ADH1B*2. Para ello, el cDNA de la ADH silvestre de rata (rADH-
47Arg) se mutó para codificar una enzima de rata (rADH-47His), análoga a la enzima
humana ADH1B*2. Con este material genético se construyeron vectores plasmidiales y
adenovirales que permitieron expresar el gen de la enzima ADH de rata mutada
(rADH-47His) y ADH silvestre (rADH-47Arg) en células de riñón humano, en hepatoma
de rata y en el hígado de ratas bebedoras de alcohol de la línea UChB. La transfección de células de riñón humano (que no expresan actividad ADH
endógena) con el cDNA de rADH-47His resultó en la expresión de una ADH con una
Km 10 veces mayor (p<0,001) para NAD+ y una Ki 2 veces mayor (p<0,001) para NADH
que la observada al transfectar el cDNA de rADH-47Arg. Estos cambios en la afinidad
por tales co-factores son análogos a los que produce la mutación natural (Arg47His) en
la enzima humana ADH1B*2.
La transducción in vitro de células de hepatoma de rata en cultivo con los vectores
AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg mostró que ambos vectores se expresan en
células hepáticas y que la Vmax de la enzima mutada rADH-47His es 8 veces mayor
que la de la enzima silvestre rADH-47Arg. En estudios in vivo, se administraron los
vectores adenovirales codificantes de rADH-47His y rADH-47Arg a ratas bebedoras de
la línea UChB. Las ratas transducidas por vía intravenosa (5 x 1012 pv/kg) con los
vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron respectivamente un
aumento de 90% (p<0,01) y 30% (p<0,01) en la actividad hepática de la ADH. Al recibir
una dosis estándar de etanol (1 g/kg, i.p.), las ratas transducidas con los vectores AdVrADH-
47His y AdV-rADH-47Arg mostraron un aumento transitorio en los niveles
arteriales de acetaldehído, con valores máximos a los 2,5 minutos de recibir etanol,
niveles que fueron respectivamente 5 veces (p<0,001) y 3,5 veces (p<0,001) más altos
que los detectados en los animales controles. Las ratas transducidas con los vectores
adenovirales AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron además una marcada
reducción de 50% (p<0,001) y 30% (p<0,01) en el consumo voluntario de alcohol.
Los resultados obtenidos en esta tesis indican que, en ratas, la expresión de una
deshidrogenasa alcohólica de elevada actividad (rADH-47His), análoga a la enzima
humana rápida ADH1B*2, resulta en un aumento transitorio del acetaldehído en sangre
arterial al recibir etanol y en una disminución en el consumo voluntario de alcohol.
Estos resultados podrían explicar el mecanismo de protección del alcoholismo en
humanos asociado a la enzima ADH1B*2 y dar origen a nuevas estrategias
terapéuticas para esta enfermedad / Alcoholism is one of the most prevalent types of drug dependence in the world.
However, there is evidence that individuals bearing certain polymorphisms in genes
coding for enzymes involved in the metabolism of ethanol are protected against this
condition. In humans, ethanol is metabolized mainly by hepatic alcohol dehydrogenase
(ADH) to acetaldehyde, which is oxidized to acetate by mitochondrial aldehyde
dehydrogenase (ALDH2). In some East Asians, a point mutation in the ALDH2 gene
(ALDH2*2) abolishes the activity of this enzyme and upon ethanol consumption results
in marked elevations of blood acetaldehyde. This increase in blood acetaldehyde levels
lead to marked dysphoric effects that deter individuals to continue drinking. Another
important polymorphism is that carried by individuals bearing a fast variant of ADH
(ADH1B*2; Arg47His) which show also a marked protection against alcoholism. In spite
of the 100-fold higher Vmax of ADH1B*2 (47His) vs. ADH1B*1(47Arg), individuals who
carry the ADH1B*2 allele show neither an increased rate of ethanol elimination nor
higher blood acetaldehyde levels upon ethanol intake. Thus, the mechanism that leads
to this marked protection against alcoholism is unknown.
The aim of this work was to investigate the possible mechanism by which the ADH1B*2
allele protects against alcoholism. This was studied in rats bred for their high ethanol
intake, which underwent transduction with a rat analogue of human ADH1B*2. For this
purpose, the rat wild type cDNA coding for ADH (rAdh-47Arg) was mutated to encode
His47 (rAdh-47His). This genetic material was incorporated into suitable plasmids and
adenoviral vectors, which were used to express the mutated (rADH-47His) and wild
type rat ADH (rADH-47Arg) genes into (i) human embryonic kidney cells, (ii) rat
hepatoma cells and (iii) liver of UChB alcohol-preferring rats. The transduction of human embryonic kidney cells, which lack ADH activity, with rADH-
47His cDNA leads to the expression of an ADH that shows a 10-fold (p<0,001) higher
Km for NAD+ and a 2-fold (p<0,001) higher Ki for NADH than those observed when
expressing the wild type rADH-47Arg. These changes in the affinity for nicotinamide
adenine dinucleotides were found to be analogous to those produced in the human
enzyme ADH1B*2 by the Arg47His aminoacidic change.
The in vitro transduction of rat hepatoma cells with the AdV-rADH-47His or AdV-rADH-
47Arg adenoviral vectors confirmed the ability of both vectors to generate active ADHs.
The Vmax of rADH-47His was 8-fold higher than that of rADH-47Arg. Liver ADH activity
in UChB alcohol-preferring rats transduced in vivo with the AdV-rADH-47His or AdVrADH-
47Arg adenoviral vectors was increased 90% (p<0,01) and 30% (p<0,01)
respectively. Upon the administration of ethanol (1 g/kg, i.p.) to rats that received either
AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg, showed a marked surge (burst) in arterial
acetaldehyde level, reaching maximal levels 2,5 minutes after ethanol injection. These
levels were, respectively, 5- and 3.5-fold higher (P<0.001) than those of control
animals. Rats that received the AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg vectors showed,
respectively, a reduction of 50% (p<0,001) and 30% (p<0,01) in their voluntary ethanol
intake.
The present study in animals transduced with the rat equivalent of human ADH1B*2
shows that high levels of arterial acetaldehyde occur only during the first few minutes of
ethanol metabolism, which could be responsible for the reduction in voluntary ethanol
intake seen in these animals. These observations may constitute the basis of the
protection against alcoholism seen in humans who carry the ADH1B*2 allele, and
would provide elements for new therapeutic strategies against alcoholism
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105174 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Rivera Meza, Mario |
| Contributors | Israel Jacard, Yedy, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Escuela de Graduados |
| Publisher | Universidad de Chile, CyberDocs |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Rivera Meza, Mario Francis |
Page generated in 0.0084 seconds