Doctor en Bioquímica / El alcoholismo es una enfermedad multifactorial que genera una serie de trastornos personales, sociales y de salud pública. Según estimaciones del Ministerio de Salud de Chile el abuso en el consumo de alcohol y el alcoholismo causa pérdidas al país por US$3.000 millones anuales. Luego de la oxidación hepática del etanol, el acetaldehído generado es metabolizado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica 2 (ALDH2*1). En la población Asiática existen individuos que poseen una variante de la ALDH2 con baja actividad (ALDH2*2) los que experimentan un marcado aumento del acetaldehído sanguíneo después de una ingesta alcohólica. Este incremento del acetaldehído causa diversos efectos tales como el enrojecimiento facial, palpitaciones, hipotensión, cefaleas y náuseas (conocido como “fenotipo asiático”) los que producen un rechazo al consumo del alcohol. Los heterocigotos (ALDH2*1/ALDH2*2) beben moderadamente, mientras que los homocigotos (ALDH2*2/ALDH2*2) son abstemios. El tratamiento farmacológico del alcoholismo se basa en el uso de diversos medicamentos como la naltrexona y el acamprosato que actúan en el sistema nervioso central bloqueando los receptores de endorfinas y NMDA, inhibiendo la sensación de placer asociada al alcohol o disminuyendo los síntomas de la abstinencia alcohólica. Otro fármaco utilizado es el disulfiram, un modificador químico de grupos sulfhidrilos, que inhibe la ALDH2 produciendo un aumento en el nivel de acetaldehído cuando el paciente bebe alcohol, emulando el fenotipo asiático. Estos fármacos requieren administración diaria lo que a causa de la baja adhesión a los tratamientos farmacológicos, reduce su eficacia terapéutica. Un nuevo fármaco de efecto prolongado, que emule el fenotipo asiático sin los efectos secundarios del disulfiram, sería de gran ayuda en el campo del alcoholismo. En esta tesis se evaluó la utilidad de dos algoritmos para diseñar racionalmente siRNAs eficientes que disminuyan la actividad de la ALDH2, mediante la degradación selectiva de su mensajero. El objetivo final fue generar un siRNA como herramienta genética en el campo del alcoholismo o como posible fármaco para su tratamiento. Se diseñaron y estudiaron tres RNAs interferentes dirigidos a distintos sitios del RNA mensajero de la ALDH2 de rata. Dos de ellos disminuyen en 60-70% la actividad de la ALDH2 en células humanas HEK-293 que expresan el gen de la enzima de rata. Empleando la secuencia del RNA interferente más prometedor (siRNA2) se diseñaron y probaron tres genes que, estando bajo el control del promotor del RNA U6 humano, dan origen a horquillas de RNA (shRNA a, b y c) precursoras del siRNA2. El shRNAc, codificado en un plásmido, disminuyó en 50% la actividad de la ALDH2 en células HEK-293. La reducción de actividad concuerda con el 60% de disminución de su mensajero. Esta disminución es específica, puesto que el mensajero de la β-actina y el de IFITM-1 se mantuvieron constantes. La transducción de células de hepatoma de rata H4-II-E-C3 con un vector adenoviral de 1ra generación que codifica la misma horquilla (AdV-shRNAc) disminuyó en 10-15% la actividad de la ALDH2 endógena. La pérdida de eficiencia probablemente se debe a la inhibición de exportina 5 y Dicer, por acción del RNA VAI codificado en los adenovirus. Finalmente, los algoritmos permitieron diseñar siRNAs que reducen la actividad de la ALDH2 por sobre el 50%. La transfección de células humanas (HEK-293) con dos de los tres siRNAs sintetizados químicamente o con un plásmido que codifica un shRNA, redujeron significativamente la actividad de la ALDH2 en células humanas, estableciendo que la interferencia por RNA es una estrategia de silenciamiento génico de utilidad para disminuir la actividad de la ALDH2.

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / En el metabolismo heterotrófico, NADH y NADPH se producen a partir de la oxidación de intermediarios por las deshidrogenasas presentes en las vías del metabolismo central. Durante el crecimiento de Escherichia coli en glucosa como única fuente de carbono, un tercio de la producción total del NADPH proviene de las deshidrogenasas de la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato: la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Diversos grupos han estudiado como se altera la fisiología de E. coli cuando se modifican las razones NADH/NAD y NADPH/NADP, encontrando que la sobreproducción de NADPH puede llevar a la inviabilidad celular cuando se utiliza glucosa como única fuente de carbono. Estudios para comprender la importancia del balance de cofactores han llevado a cambiar la especificidad de sustrato de estas enzimas, de modo que puedan usar NAD como cofactor en lugar de NADP. Este enfoque ha sido fructífero en el caso de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, pero no en el caso de 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la descarboxilación de 6-fosfogluconato para producir ribulosa 5-fosfato, usando NADP como cofactor con alta especificidad. Una forma de estudiar este problema es investigando el efecto en el metabolismo, de forzar el flujo de glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato. Bajo condiciones de crecimiento en glucosa, la sobreproducción de NADPH generaría una reducción significativa de la tasa de crecimiento de E. coli. La hipótesis de este trabajo es que el cambio de especificidad in vivo de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de Escherichia coli desde NADP a NAD, permite una recuperación parcial en la tasa de crecimiento en una cepa Δpgi ΔudhA, incapaz de sobrevivir en medio mínimo con glucosa como única fuente de carbono, debido a la alteración en la topología de las vías centrales del metabolismo. Para cambiar la especificidad por cofactor de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, en este trabajo, se implementaron metodologías de diseño racional y evolución dirigida para lograr la forma NAD específica. Para identificar posiciones determinantes de la especificidad por NAD(P) se realizó un análisis de traza evolutiva de la familia 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Se encontró 3 loops que serían relevantes para la especificidad por NAD(P), incluyendo el motivo NRX3K contenido en el loop β2-α2 del bolsillo de unión a dinucleótido en la enzima de E. coli. Desde este análisis, se generó mediante mutagénesis sitio dirigida la variante N33D-R34V-S35K-K38N. Debido a la presencia de estas mutaciones, la KM para NAD disminuyó 5 veces mientras que no se observó actividad con NADP. Se generó la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd mediante la eliminación del gen de fosfoglucosa isomerasa, el operón Entner-Doudoroff, de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa y de la transhidrogenasa UdhA, que reoxida el NADPH. Esta cepa presentó una marcada disminución en la tasa de crecimiento debido al incremento en la producción de NADPH al desviar el flujo de glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato. Esta mutante se transformó con un plásmido que poseía la versión del gen de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD, encontrándose que la presencia de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NADH le permite a esta bacteria recuperar la capacidad de crecer en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono. Para incrementar la especificidad de la enzima por NAD, se generó una librería por mutagénesis de saturación de sitios en 4 residuos dentro de los 3 loops. Además, se desarrolló un sistema de selección basado en la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd. Debido a las diferencias en las velocidades de crecimiento, se logró diseñar un sistema de selección basado en el enriquecimiento de cultivo, aislando aquellas cepas que estaban complementadas con 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NAD. Sin embargo, al usar el protocolo propuesto se observó que los niveles de expresión de las variantes de enzimas varían considerablemente entre antes y después de someter la cepa a selección en medio mínimo, por lo que el protocolo debe ser optimizado para que el cepa sea utilizada como sistema de selección para una librería de variantes 6-fosfogluconato deshidrogenasa. De este trabajo se concluye que el uso in vivo de una variante de 6-fosfogluconato deshidrogenasa con un cambio de especificidad de cofactor desde NADP a NAD, permite recuperar parcialmente el crecimiento en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono, probablemente debido a modificaciones en el balance de los cofactores NAD(P)H/NAD(P). Finalmente, la relación entre el crecimiento y la especificidad de las deshidrogenasas del metabolismo central puede ser utilizada como método de selección de variantes con especificidad de cofactor cambiada de NADP a NAD mediante evolución dirigida / In the heterotrophic metabolism, NADH and NADPH are produced from the oxidation of intermediates by dehydrogenases present in central metabolism pathways. During the growth of Escherichia coli in glucose as sole carbon source, one third of the total NADPH production belongs to the oxidative branch of the pentose phosphate pathway: the glucose 6-phosphate dehydrogenase and the 6-phosphogluconate dehydrogenase. Several groups have been studying how the E. coli physiology is modified when NADH/NAD and NADPH/NADP are altered, finding that NADPH overproduction could lead to cell unviability when glucose is the sole carbon source. Studies to understand the importance of cofactor balance have lead to change the substrate specificity of theses enzymes, in order to use NAD as cofactor instead of NADP. This approach has been succeeding for glucose 6-phosphate dehydrogenase, but not for 6-phosphogluconate dehydrogenase. This enzyme catalyzes the decarboxylation of 6-phosphogluconate to produce ribulose 5-phosphate, using NADP as cofactor with high specificity. One form of to study this problem is investigating the effect in the metabolism, due to force the glucose flux through the pentose phosphate pathway. Under glucose growth conditions, NADPH overproduction would generate a significant reduction in growth rate of E. coli. The hypothesis of this work is that the specificity change in vivo of the 6-phosphogluconate dehydrogenase from E. coli, from NADP to NAD, allows to restore partially the growth rate in a Δpgi ΔudhA strain, unable to grow in minimal media with glucose as sole carbon source, due to modifications in the topology of the central metabolism pathways. To change the cofactor specificity of the 6-phosphogluconate dehydrogenase, in this work, rational design and directed evolution methodologies were implemented to obtain the NAD-specific form. To identify determinants positions of the NAD(P) specificity, evolutionary trace analysis to the 6-phosphogluconate dehydrogenase family was performed, finding 3 loops that could be relevant for NAD(P) specificity, including the β2-α2 loop containing the NRX3K motif of the dinucleotide binding pocket of the E. coli enzyme. From this analysis, the variant N33D-R34V-S35K-K38N was generated by site-directed mutagenesis. Due the presence of these substitutions, the NAD KM decreased 5-times and no activity was observed with NADP. A E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd strain was generated by deleting phosphoglucose isomerase gen, Entner-Doudoroff operon, 6-phosphogluconate dehydrogenase and UdhA transhydrogenase, which reoxidize NADPH. This strain shows a remarkable decreased growth rate due to NADPH production increment by forcing glucose flux through pentose phosphate pathway. This strain was transformed with a plasmid bearing a 6-phosphogluconate dehydrogenase gen variant NAD-dependent, finding that the presence of the NADH-producing 6-phosphogluconate dehydrogenase allows the bacteria to restore the capacity to grow in minimal media with glucose as sole carbon source. In order to increase the NAD specificity, a clone library by site-saturation mutagenesis of 4 residues within the 3 loops was performed. In addition, a selection strategy based on the designed strain was developed. Since the growth rates differences, a selection system based on enrichment culture, isolating NAD-producing 6-phosphogluconates bearing strains. However, with the proposed protocol, enzymes variants expression levels vary between before and after strain culturing in minimal media, so the protocol must be optimized in order to use the strain as a selection system for a 6-phosphogluconate dehydrogenase library. We conclude from this work that the usage in vivo of a 6-phopshogluconate dehydrogenase variant with a specific change from NADP to NAD, allows partially restore the growth rate of an unviable strains in glucose as sole carbon source, probably by modifications in the NAD(P)H/NAD(P) cofactors balance. Finally, the relation between growth rate and central metabolism dehydrogenase specificity can be used for biotechnological purposes, like a selection system for directed evolution / FONDECYT 1121170 y 1140754 ; CONICYT PCHA/Beca Magíster

El alcoholismo está determinado por factores genéticos y medioambientales. El factor genético principal corresponde a los genes que codifican las enzimas que metabolizan el alcohol. El metabolismo hepático del etanol contempla la oxidación del etanol a acetaldehído mediante la deshidrogenasa alcohólica y la posterior oxidación del acetaldehído a acetato, llevada a cabo fundamentalmente por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). Un 30-40 % de la población oriental presenta una mutación que genera una ALDH2 sin actividad; al beber alcohol, estos individuos sufren un aumento en el nivel de acetaldehído sanguíneo, lo que trae como consecuencia efectos disfóricos que generan aversión por el alcohol. El fármaco disulfiram, utilizado para el tratamiento del alcoholismo, imita este fenotipo asiático ya que inactiva covalentemente a la ALDH2. Sin embargo, su eficacia farmacológica está contrarrestada por la variabilidad individual, la toxicidad, el requerimiento de ingesta diaria y por la necesidad de que el paciente se comprometa a medicarse. El desarrollo de fármacos alternativos más específicos y de mayor duración es concebible en base a disminuir la cantidad de la enzima ALDH2 disminuyendo la expresión de su gen. Ello se puede efectuar con moléculas capaces de degradar el mRNA de la ALDH2 como las ribozimas, moléculas de RNA que reconocen su blanco por enlaces de Watson y Crick y lo cortan en una secuencia específica. En este trabajo de tesis se determinó si la ribozima de horquilla RzCG20 ―capaz de disminuir la actividad de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo― es capaz de producir el mismo efecto in vivo al entregar, en un vector adenoviral, un gen que codifica dicha ribozima a ratas UChB dependientes de alcohol, de manera que al consumirlo sufran un aumento del acetaldehído sanguíneo cuyos efectos aversivos disminuyan el consumo voluntario de alcohol. Se produjeron y purificaron vectores adenovirales que codifican la ribozima RzCG20, la ribozima control RzCG20c diseñada para unirse a su blanco sin degradarlo, o un RNA no funcional control. Se transdujeron células de hepatoma de rata en cultivo con las preparaciones adenovirales obtenidas para asegurar que eran biológicamente activas, es decir, que eran capaces de disminuir la actividad de la ALDH2. En experimentos in vivo, los vectores adenovirales se inyectaron en la vena de la cola de ratas que voluntariamente beben gran cantidad de alcohol (ratas UChB), determinándose que una sola administración del vector adenoviral codificante de la ribozima RzCG20 a ratas UChB (n=5) disminuye en ~50 % el consumo de alcohol durante 34 días de un periodo de acceso restringido a etanol (1 h al día). Igual efecto se obtuvo con el adenovirus codificante de la ribozima control RzCG20c; el adenovirus control y el vehículo no disminuyeron el consumo. A los 39 días postinyección, las ratas que recibieron los vectores adenovirales codificantes de las ribozimas evidenciaron una reducción de ~24 % en la actividad de la ALDH2 hepática (medición espectrofotométrica) y un aumento en el acetaldehído sanguíneo dos veces mayor que los animales controles (según cromatografía de gases) luego de una administración intraperitoneal de alcohol (1 g/kg). En conclusión, se demostró actividad biológica específica in vivo de la ribozima RzCG20 y la ribozima control RzCG20c para silenciar el mRNA de la ALDH2: ambas ribozimas lograron una disminución parcial de la actividad de la ALDH2 sin afectar la actividad de otras ALDHs. Las posibles diferencias mecanísticas entre las ribozimas no se manifestaron en sus efectos bioquímicos sugiriendo que la sola unión de la ribozima control RzCG20c a los 17 nucleótidos reconocidos en el mRNA de la ALDH2 es suficiente para reducir, por bloqueo del mRNA, la actividad de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial en un grado que permite disminuir el consumo de alcohol. En suma, el desarrollo de una terapia génica para el alcoholismo disminuyendo la expresión del mRNA de la ALDH2 mediante ribozimas de horquilla es promisorio.

Doctor en Farmacología / El alcoholismo es una de las adicciones de mayor prevalencia en el mundo. Sin embargo, se ha visto que la presencia de ciertos polimorfismos en los genes de las enzimas que metabolizan el etanol, son capaces de proteger a sus portadores de desarrollar esta enfermedad. En humanos el etanol es metabolizado principalmente en el hígado por la deshidrogenasa alcohólica (ADH) generando acetaldehído, metabolito que es oxidado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). En algunos individuos de la población asiática, una mutación puntual en el gen de la ALDH2 (ALDH2*2) elimina la actividad de esta enzima, lo que produce una gran acumulación de acetaldehído en la sangre luego del consumo de bebidas alcohólicas. Este aumento de los niveles sanguíneos de acetaldehído genera marcados efectos disfóricos que provocan un rechazo al consumo de alcohol. Por otra parte, los individuos que poseen una variante rápida de la ADH (ADH1B*2; 47His) presentan también una marcada protección contra el alcoholismo respecto a portadores de la enzima normal (ADH1B*1; 47Arg). A pesar de que la enzima rápida ADH1B*2 tiene una Vmax 100 veces mayor que la enzima normal ADH1B*1, los individuos portadores del alelo ADH1B*2 no presentan una mayor velocidad de eliminación del etanol y tampoco niveles aumentados de acetaldehído (medidos en sangre venosa) que expliquen su protección al alcoholismo. En esta tesis se desarrolló un modelo animal en ratas bebedoras de alcohol que, al expresar una ADH de elevada actividad por entrega génica, podría ayudar a entender los mecanismos involucrados en la protección al alcoholismo observada en portadores de la enzima rápida ADH1B*2. Para ello, el cDNA de la ADH silvestre de rata (rADH- 47Arg) se mutó para codificar una enzima de rata (rADH-47His), análoga a la enzima humana ADH1B*2. Con este material genético se construyeron vectores plasmidiales y adenovirales que permitieron expresar el gen de la enzima ADH de rata mutada (rADH-47His) y ADH silvestre (rADH-47Arg) en células de riñón humano, en hepatoma de rata y en el hígado de ratas bebedoras de alcohol de la línea UChB. La transfección de células de riñón humano (que no expresan actividad ADH endógena) con el cDNA de rADH-47His resultó en la expresión de una ADH con una Km 10 veces mayor (p<0,001) para NAD+ y una Ki 2 veces mayor (p<0,001) para NADH que la observada al transfectar el cDNA de rADH-47Arg. Estos cambios en la afinidad por tales co-factores son análogos a los que produce la mutación natural (Arg47His) en la enzima humana ADH1B*2. La transducción in vitro de células de hepatoma de rata en cultivo con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg mostró que ambos vectores se expresan en células hepáticas y que la Vmax de la enzima mutada rADH-47His es 8 veces mayor que la de la enzima silvestre rADH-47Arg. En estudios in vivo, se administraron los vectores adenovirales codificantes de rADH-47His y rADH-47Arg a ratas bebedoras de la línea UChB. Las ratas transducidas por vía intravenosa (5 x 1012 pv/kg) con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron respectivamente un aumento de 90% (p<0,01) y 30% (p<0,01) en la actividad hepática de la ADH. Al recibir una dosis estándar de etanol (1 g/kg, i.p.), las ratas transducidas con los vectores AdVrADH- 47His y AdV-rADH-47Arg mostraron un aumento transitorio en los niveles arteriales de acetaldehído, con valores máximos a los 2,5 minutos de recibir etanol, niveles que fueron respectivamente 5 veces (p<0,001) y 3,5 veces (p<0,001) más altos que los detectados en los animales controles. Las ratas transducidas con los vectores adenovirales AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron además una marcada reducción de 50% (p<0,001) y 30% (p<0,01) en el consumo voluntario de alcohol. Los resultados obtenidos en esta tesis indican que, en ratas, la expresión de una deshidrogenasa alcohólica de elevada actividad (rADH-47His), análoga a la enzima humana rápida ADH1B*2, resulta en un aumento transitorio del acetaldehído en sangre arterial al recibir etanol y en una disminución en el consumo voluntario de alcohol. Estos resultados podrían explicar el mecanismo de protección del alcoholismo en humanos asociado a la enzima ADH1B*2 y dar origen a nuevas estrategias terapéuticas para esta enfermedad / Alcoholism is one of the most prevalent types of drug dependence in the world. However, there is evidence that individuals bearing certain polymorphisms in genes coding for enzymes involved in the metabolism of ethanol are protected against this condition. In humans, ethanol is metabolized mainly by hepatic alcohol dehydrogenase (ADH) to acetaldehyde, which is oxidized to acetate by mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2). In some East Asians, a point mutation in the ALDH2 gene (ALDH2*2) abolishes the activity of this enzyme and upon ethanol consumption results in marked elevations of blood acetaldehyde. This increase in blood acetaldehyde levels lead to marked dysphoric effects that deter individuals to continue drinking. Another important polymorphism is that carried by individuals bearing a fast variant of ADH (ADH1B*2; Arg47His) which show also a marked protection against alcoholism. In spite of the 100-fold higher Vmax of ADH1B*2 (47His) vs. ADH1B*1(47Arg), individuals who carry the ADH1B*2 allele show neither an increased rate of ethanol elimination nor higher blood acetaldehyde levels upon ethanol intake. Thus, the mechanism that leads to this marked protection against alcoholism is unknown. The aim of this work was to investigate the possible mechanism by which the ADH1B*2 allele protects against alcoholism. This was studied in rats bred for their high ethanol intake, which underwent transduction with a rat analogue of human ADH1B*2. For this purpose, the rat wild type cDNA coding for ADH (rAdh-47Arg) was mutated to encode His47 (rAdh-47His). This genetic material was incorporated into suitable plasmids and adenoviral vectors, which were used to express the mutated (rADH-47His) and wild type rat ADH (rADH-47Arg) genes into (i) human embryonic kidney cells, (ii) rat hepatoma cells and (iii) liver of UChB alcohol-preferring rats. The transduction of human embryonic kidney cells, which lack ADH activity, with rADH- 47His cDNA leads to the expression of an ADH that shows a 10-fold (p<0,001) higher Km for NAD+ and a 2-fold (p<0,001) higher Ki for NADH than those observed when expressing the wild type rADH-47Arg. These changes in the affinity for nicotinamide adenine dinucleotides were found to be analogous to those produced in the human enzyme ADH1B*2 by the Arg47His aminoacidic change. The in vitro transduction of rat hepatoma cells with the AdV-rADH-47His or AdV-rADH- 47Arg adenoviral vectors confirmed the ability of both vectors to generate active ADHs. The Vmax of rADH-47His was 8-fold higher than that of rADH-47Arg. Liver ADH activity in UChB alcohol-preferring rats transduced in vivo with the AdV-rADH-47His or AdVrADH- 47Arg adenoviral vectors was increased 90% (p<0,01) and 30% (p<0,01) respectively. Upon the administration of ethanol (1 g/kg, i.p.) to rats that received either AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg, showed a marked surge (burst) in arterial acetaldehyde level, reaching maximal levels 2,5 minutes after ethanol injection. These levels were, respectively, 5- and 3.5-fold higher (P<0.001) than those of control animals. Rats that received the AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg vectors showed, respectively, a reduction of 50% (p<0,001) and 30% (p<0,01) in their voluntary ethanol intake. The present study in animals transduced with the rat equivalent of human ADH1B*2 shows that high levels of arterial acetaldehyde occur only during the first few minutes of ethanol metabolism, which could be responsible for the reduction in voluntary ethanol intake seen in these animals. These observations may constitute the basis of the protection against alcoholism seen in humans who carry the ADH1B*2 allele, and would provide elements for new therapeutic strategies against alcoholism

El primer que es va abordar en la present Tesi Doctoral va ser la determinació de l'estructura primària completa de l'alcohol deshidrogenasa humana de la classe IV, de la qual només se'n coneixien alguns fragments parcials obtinguts per anàlisi de pèptids, en col.laboració amb el grup del Prof. Hans Jörnvall, del Karolinska Institutet d'Estocolm. Es va optar, doncs, per la clonació del seu cDNA mitjançant el triatge d'una biblioteca, utilitzant com a sonda un fragment del cDNA de l'ADH4 de rata. Posteriorment, es va procedir a l'estudi de la rellevància funcional de la posició 294, que presenta una valina en la forma humana i una alanina en la de rata. Aquesta posició està situada en la regió intermèdia de la cavitat d'unió del substrat. Així, es va fer un treball paral.lel de mutagènesi dirigida d'aquest aminoàcid, realitzant substitucions recíproques en els dos enzims. En la present Tesi Doctoral, es va expressar en E. coli i es va obtenir el mutant Ala294Val. Es van caracteritzar l'enzim recombinant i el mutant amb etanol i retinoides. També es va desenvolupar un model molecular de l'estructura tridimensional de l'enzim ADH4 de rata i es van fer simulacions de la interacció de retinoides amb els dos enzims, mitjançant estudis de docking. D'altra banda, en el nostre grup es va identificar una forma present en la mucosa digestiva de l'amfibi Rana perezi, que mostrava analogies estructurals i funcionals amb els enzims ADH4 de mamífer. La determinació parcial de la seva seqüència d'aminoàcids va suggerir que aquesta forma d'alcohol deshidrogenasa era dependent de NADP(H) en lloc de NAD(H), degut a la substitució de l'aspàrtic 223 per glicina. Els estudis cinètics subsegüents van confirmar una especificitat de coenzim fins aleshores inèdita entre les alcohol deshidrogenases de vertebrat. Per a obtenir l'estructura primària completa d'aquest enzim es va procedir a la clonació del seu cDNA, utilitzant la PCR i estratègies d'amplificació dels extrems de cDNA. Prosseguint amb la determinació de la presència en altres espècies de formes d'ADH, es va estudiar el pollastre, com a espècie model de les aus. Es va identificar un enzim amb activitat alcohol deshidrogenasa i amb preferència per NADP(H), que s'expressava en el tracte digestiu superior i en ull. L'enzim responsable d'aquesta activitat va resultar ser una aldo_ceto reductasa, que presentava la peculiaritat de ser activa amb etanol i amb retinoides, un fet fins aquell moment mai observat en aquesta família. Es va clonar el cDNA de l'aldo_ceto reductasa i es va obtenir la seva seqüència completa. Es va estudiar el patró d'expressió del gen per transferència Northern. Es van obtenir les constants cinètiques de l'enzim amb diversos substrats, incloent retinoides. Per a estudiar la base estructural de les propietats de l'enzim, es va desenvolupar un model molecular i es van realitzar simulacions de docking. / Initially, in the present Doctoral Thesis, the primary structure of human alcohol dehydrogenase class IV (ADH4) was determined by screening of a cDNA library, and using a DNA fragment of rat ADH4.The function of position 294 in human and rat ADH4 was studied by site-directed mutagenesis. Position 294 is localized in the middle region of the substrate-binding pocket, and is occupied by a Valine in human ADH4 and an Alanine in rat ADH4, being this substitution the most significant difference between both enzymes. Rat ADH4 and rat Ala294Val mutant were kinetically characterized, with ethanol and all-trans, 9-cis and 13-cis retinoids. A molecular model of rat ADH4 was built, and docking studies with retinoid isomers were performed.On the other hand, in our group, an ADH from an amphibian species (Rana perezi) was characterized. This enzyme was kinetically similar to rat and human ADH4. However, this enzyme was NADP(H)-dependent, instead od NAD(H)-dependent like all other vertebrate ADHs. In the present Doctoral Thesis, the cDNA of the amphibian ADH (named ADH8) was obtained and the structural features that correlate with its distinct NADP(H) dependence were analyzed. Finally, the presence of an ADH homologous to human ADH4 or amphibian ADH NADP(H)-dependent was studied in an avian species (chicken, Gallus Domesticus). An enzyme NADP(H)-dependent, similar to amphibian ADH8, was characterized. However, the analysis of the primary structure revealed that this enzyme was not an ADH from the medium chain dehydrodrogenase/reductase superfamily. The ADH characterized from chicken tissues was an aldo-keto reductase, an enzyme from a completely different family. Chicken AKR was unique in all AKR superfamily because it was able to use ethanol and retinoids as substrates.

Se ha abordado el estudio detallado de la localización de distintas formas de alcohol deshidrogenasa (ADH) en tejidos de rata y, en particular, en el sistema vascular, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central y tejidos oculares. Se han estudiado esencialmente ADH1 y ADH4, que son los enzimas más relevantes en la oxidación de etanol a acetaldehído, y en la oxidación de retinol a retinal en la vía de síntesis del ácido retinoico.ADH4 se detectó como la forma principal en los vasos sanguíneos de la rata, mientras que en los vasos humanos ADH1B era el enzima predominante. Tanto ADH1 como ADH4, se han detectado a lo largo de todo el tracto gastrointestinal, principalmente en la mucosa, variando su cantidad relativa y su ubicación celular en función del área estudiada. ADH4 es más abundante en las partes más externas del tracto (boca, esófago, colon y recto), mientras que ADH1 es la forma mayoritaria en el intestino. En el cerebro, mediante hibridación in situ, ambas formas de ADH se han localizado en el cerebelo, formación hipocampal y áreas muy concretas de la corteza cerebral, mostrando colocalización en algunos tipos celulares y una expresión específica en otros. La inmunodetección de ADH4 en homogeneizados de diferentes regiones cerebrales ha confirmado la presencia de la proteína en áreas concretas del SNC donde también se ha localizado su mRNA. Ambas clases han sido también detectadas en el sistema ventricular y vascular asociado al SNC. En los tejidos oculares, la proteína ADH4 se ha localizado en la coroides, cuerpo ciliar, nervio óptico y en capas concretas de la córnea y retina.Finalmente, se ha comparado el patrón de expresión ADH en tejido hepático con el de una línea celular de hepatocarcinoma. La línea de hepatocarcinoma de rata H4IIEC3 mostró la expresión de ADH1 y ADH3, presentes en hígado normal, y, además, ADH4, ausente en hígado. Se investigó el efecto del ácido retinoico sobre la expresión de cada una de las tres formas de ADH. Se ha observado un aumento de los niveles de mRNA de ADH1 y un descenso de los de ADH4, mientras que los niveles de mRNA de ADH3 se mantuvieron constantes.La distribución de ADH1 y ADH4, junto con sus propiedades cinéticas y su regulación, permiten inferir algunas de sus funciones fisiológicas en el metabolismo del etanol y de los retinoides, la reducción de aldehídos citotóxicos derivados de la peroxidación lipídica, el catabolismo de las catecolaminas, etc. Asimismo, el metabolismo endógeno de etanol, proporciona una base molecular para comprender las alteraciones causadas por el abuso del alcohol en determinados órganos y tejidos. En este sentido, proponemos la hipótesis de que algunos de los efectos tóxicos del etanol podrían explicarse por la interferencia, a nivel de la ADH, con la vía de síntesis del ácido retinoico.

L'àcid retinoic, en les seves formes tot-trans- i 9-cis-, actua com a lligand de receptors nuclears específics, i és essencial en processos de creixement, desenvolupament i manteniment epitelial. La via de formació de l'àcid retinoic inclou dos pasos d'oxidació, de retinol a retinal i de retinal a àcid retinoic. S'han descrit diversos enzims que poden participar en el primer pas, com les ADH i les RDH, però es desconeix la contribució de cada enzim en el procés.S'han clonat, expressat i purificat ADH1B1, ADH2B2 i ADH4 humanes, i també ADH1 i ADH4 de ratolí que, per primera vegada, s'han caracteritzat en la seva forma recombinant. S'han determinat les constants cinètiques de totes aquestes ADHs amb tot-trans- i 7-cis-, 9-cis-, 11-cis- i 13-cis-retinol i els corresponents retinals. En general, les ADH4 humana i de ratolí mostren constants cinètiques similars, i són més eficients que les ADH1. Totes les ADHs utilitzen com a substrats tant 11-cis-retinol com 11-cis-retinal, compostos rellevants en el cicle visual. S'ha observat que l'ADH4 mostra especificitat per a l'oxidació d'11-cis-retinol sobre la reducció d'11-cis-retinal, una propietat única entre totes les ADHs per a qualsevol parella de substrats alcohol/aldehid. Mitjançant mètodes de simulació molecular, i clonatge, expressió i caracterització del mutant de l'ADH4 humana M141L, hem demostrat que el residu 141, situat a la regió mitjana del túnel hidrofòbic del seti actiu de l'ADH, és essencial per definir aquesta especificitat de l'ADH4 sobre les ADH1. La immunolocalització de l'ADH4 a l'epiteli pigmentat i en moltes capes de la retina, dóna suport a la participació de l'ADH4 en diferents reaccions amb retinoides. L'activitat citosòlica de l'ADH4 en l'epiteli pigmentat pot ser complementària a l'activitat 11-cis-retinol deshidrogenasa de la RDH5, necessària per completar el cicle visual, i pot estar també implicada en la generació d'àcid retinoic a les capes neuronals de la retina.Una altra família de retinoides està constituïda per derivats oxidats en l'anell ciclohexè, com per exemple els 4-oxo-, 4-hidroxi- i 3,4-dideshidroretinol i els corresponents retinals. Tot i que són compostos poc estudiats, es coneix que alguns derivats, com els àcids 4-oxo- i el 3,4-dideshidroretinoic poden interaccionar amb receptors nuclears. Les cinètiques dels enzims ADH1B1, ADH2B2 i ADH4 humanes, i també ADH1 i ADH4 de ratolí, indiquen que el 4-oxo-retinal i el 4-hidroxi-retinol són els substrats amb una eficiència catalítica més alta d'entre tots els retinoides, especialment pel que fa a les ADH4, mentre que els 3,4-dideshidroretinoides presenten una activitat similar a la dels tot-trans-retinoides. Les dades obtingudes in vitro recolzen l'existència d'una via metabòlica per a la formació dels àcids retinoics oxidats en l'anell a partir dels corresponents retinols, amb la participació de l'ADH. Finalment, hem comprovat que la presència de Tween 80 provoca una disminució de l'activitat que resulta en una aparent inhibició competitiva en les cinètiques de l'ADH per al tot-trans-retinol, amb un augment de la Km i disminució de l'eficiència catalítica en augmentar la concentració del detergent. Això implica que els valors reals de Km són molt inferiors als publicats fins ara, tradicionalment obtinguts en presència de 0,02 % de Tween 80. Així, les ADHs presenten valors de Km pròxims als de les RDHs i, per tant, la contribució al metabolisme dels retinoides podria ser similar per a ambdós sistemes enzimàtics. Hem comprovat, espectrofotomètricament i per HPLC, que el Tween 80 manté l'estabilitat de la solució aquosa de retinoides, i que permet obtenir resultats reproduïbles i comparables entre diferents ADHs. / Studies in knockout mice support the involvement of alcohol dehydrogenases ADH1 and ADH4 in retinoid metabolism, although kinetics with retinoids are not known for the mouse enzymes. Moreover, a role of ADH in the eye retinoid interconversions cannot be ascertained due to the lack of information on the kinetics with 11-cis-retinoids. We report here the kinetics of human ADH1B1, ADH1B2, ADH4, and mouse ADH1 and ADH4 with all-trans-, 7-cis-, 9-cis-, 11-cis-, and 13-cis-isomers of retinol and retinal. These retinoids are substrates for all enzymes tested, except the 13-cis isomers which are not used by ADH1. In general human and mouse ADH4 exhibit similar activity, higher than that of ADH1, while mouse ADH1 is more efficient than the homologous human enzymes. All tested ADHs use 11-cis-retinoids efficiently. ADH4 shows much higher kcat/Km values for 11-cis-retinol oxidation than for 11-cis-retinal reduction, a unique property among mammalian ADHs for any alcohol/aldehyde substrate pair. Docking simulations and the kinetic properties of the human ADH4 M141L mutant demonstrated that residue 141, in the middle region of the active site, is essential for such ADH4 specificity. The distinct kinetics of ADH4 with 11-cis-retinol, its wide specificity with retinol isomers and its immunolocalization in several retinal cell layers, including pigment epithelium, support a role of this enzyme in the various retinol oxidations that occur in retina. Cytosolic ADH4 activity may complement the isomer-specific microsomal enzymes involved in photopigment regeneration and retinoic acid synthesis.On the other hand, alcohol dehydrogenases (ADH1 and ADH4) actively use retinoids oxidized at the cyclohexenyl ring (4-oxo-, 4-hydroxy- and 3,4-didehydro-retinoids), which are functional compounds in several cells and tissues (i.e. in human skin). Remarkably, activities with 4-oxo-retinal and 4-hydroxy-retinol (kcat = 2050 min-1 for ADH4) are the highest among retinoids, similar to those of the best aliphatic alcohols. Thus, ADH1 and ADH4 provide a metabolic pathway for the synthesis of the corresponding retinoic acids.Finally, Tween 80, a widely used detergent in the retinoid activity assay, behaves as a competitive inhibitor. The Km values for all-trans-retinol (2-3 &#61549;M), estimated in the absence of detergent, are 10-fold lower than those obtained at the usual 0.02% Tween 80. This suggests a contribution of ADH in retinoid metabolism more relevant than previously expected. However, Tween 80 stabilizes retinoids in water solution and provides a reliable and reproducible assay, suitable for comparing different ADHs and different retinoid substrates.

Doctor en Bioquímica / El alcoholismo es una enfermedad de etiología multifactorial que causa un número de problemas sociales, laborales, legales y médicos. El riesgo de un individuo de desarrollar alcoholismo está influenciado por varios genes. Algunos genes permiten el desarrollo del alcoholismo y otros genes protegen a sus portadores de esta condición. La deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) metaboliza gran parte del acetaldehído generado en el metabolismo hepático del alcohol. En algunos individuos de la población asiática, una mutación en el gen que codifica la ALDH2, disminuye o elimina la actividad de esta enzima. La inactivación de esta enzima produce una exagerada acumulación del acetaldehído sanguíneo luego del consumo de bebidas alcohólicas, lo que genera efectos disfóricos que producen un rechazo al alcohol. Este fenotipo protector descrito en la población asiática puede ser producido en alcohólicos a los cuales se ha administrado el medicamento aversivo disulfiram (Antabus®). Este fármaco, eficaz en disminuir la actividad ALDH2, es sin embargo poco específico, posee una vida media corta, muestra una gran variabilidad individual y genera una serie de efectos tóxicos por unirse en forma no específica a los grupos sulfhidrilos de varias proteínas. La terapia génica se perfila como una alternativa al actual tratamiento farmacológico del alcoholismo. Un nuevo medicamento aversivo sin los efectos secundarios del disulfiram sería de gran utilidad en el campo del alcoholismo. El tipo de terapia a desarrollar pretende imitar el fenotipo asiático, disminuyendo específicamente la actividad de la ALDH2 mediante la reducción de la traducción del mRNA. La estrategia utilizada para lograr este objetivo, es inhibir la traducción mediante la generación de un RNA antisentido de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial codificado en un vector adenoviral. En estudios en esta tesis, primeramente, el gen antisentido de la ALDH2 (cDNA de Aldh2 en posición 3’ a 5’) contenido en el vector adenoviral bajo el promotor CMV se transdujo a células de hepatoma de rata generando niveles altos de mRNA antisentido. La administración de este vector a células de hepatoma de rata disminuyó de 60 a 70% la actividad ALDH2 y aumentó 8 veces (10 μM a 80 μM) los niveles de acetaldehído acumulado cuando estas células se incubaron con etanol. En estudios in vivo, se administró el adenovirus portador del gen antisentido-Aldh2 a ratas bebedoras UChB (línea de ratas Bebedoras desarrollada en la Universidad de Chile). Las ratas que recibieron una sola dosis del vector (1012 pv/kg) por vía intravenosa, disminuyeron su consumo de alcohol en 50%, y se observó una reducción de 90% en la actividad de la ALDH2. La reducción del consumo de etanol duró 34 días, tiempo al cual el estudio se finalizó. En estudios paralelos de más corta duración (10 días), los niveles plasmáticos de acetaldehído en los animales tratados con el vector anti-Aldh2 aumentó 6 a 8 veces (8 μM a 60 μM) sobre niveles controles (6-14 μM; p<0,01) asociado a un 37,5% de inhibición de la actividad ALDH2 hepática. En conclusión, en animales que reciben el gen Aldh2-antisentido, una reducción específica en la actividad de la ALDH2 permite la elevación de los niveles de acetaldehído sistémico, que genera una aversión al etanol. Los estudios sugieren que es posible desarrollar una terapia génica específica y de larga duración para el alcoholismo / Alcoholism is defined by the compulsive excessive use of alcohol despite of negative consequences perceived by the subject. It is not only one of major public health problems due to the morbidity caused by the alcohol abuse disorder but it is also a major social problem. The risk of developing this disease is genetically influenced, with some genes being permissive and other genes protective. Most of the elimination of ethanol occurs by oxidation to acetaldehyde and further into acetate. The reactions are sequentially catalyzed by alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH). The oxidation of acetaldehyde to acetate is catalyzed primarily by ALDH2, the low Km isozyme of ALDH present in mitochondria. A mutation in the gene coding for ALDH2 present in some Asian populations, lowers or abolishes the activity of this enzyme and results in marked elevations in blood acetaldehyde upon ethanol consumption. The resulting phenotype greatly protects against alcohol abuse and alcoholism. The protective Asian phenotype can be elicited in alcoholics who are administered the aversive medication disulfiram (Antabuse®), affording these individuals the same protection from alcohol abuse. However, disulfiram is a non-specific drug that binds to sulfhydryl groups, has a short half-life, cannot be metabolized by some patients into its active metabolite, and has marked toxicity side effects, as it nonspecifically binds to sulfhydryl groups in other proteins. Gene therapy, as a new approach, opens the possibility of developing a specific aversive medication for alcoholism. This new treatment, based on the reduction of Aldh2 mRNA transduction, provides a means by which gene expression can be specifically inhibited to yield the low-ALDH2 Asian phenotype. The aim of the work presented in this thesis is to reduce Aldh2 mRNA translation in the rat by the intracellular generation of an antisense aldehyde dehydrogenase RNA coded by an antisense gene (Aldh2 cDNA in a 3´ to 5´ orientation) contained in an adenoviral vector. Rat hepatoma cells were transduced with the antisense coding gene against ALDH2 carried by the adenoviral vector, leading to the generation of high levels of antisense mRNA. The cells infected with this vector, reduced their ALDH2 activity by 60 to 70% and, in the presence of ethanol, increased 8-fold the levels of acetaldehyde (10 μM to 80 μM). In studies in vivo, the adenoviral vector coding for the antisense-Aldh2 RNA was administered to UChB rats (University of Chile alcohol dependent rats). The rats infected with a single dose of the vector (1012 vp/kg) by tail vein injection inhibited its ALDH2 activity in 90% and reduced its alcohol consumption in 50%. The reduction in alcohol consumption lasted 34 days, time at which the study was terminated. A parallel study in which rats were infected 10 days earlier with a single dose of the vector carrying the antisense gene showed a 37.5% reduction in hepatic ALDH2 activity, while acetaldehyde plasma levels following the administration of ethanol increased 6-8 fold over controls (5-10 μM to 40-60 μM) (p<0,01). Overall, rats treated with an Aldh2- antisense coding gene show significant reductions in hepatic ALDH2 activity and elevations in systemic acetaldehyde upon ethanol administration, which are accompanied by marked reductions in ethanol voluntary consumption in alcohol dependent animals. These preclinical studies suggest that a long-lasting specific gene therapy against alcoholism may be developed

Las células dendríticas (DCs) cumplen un rol fundamental en la ejecución y regulación de la respuesta inmune. En los últimos años su producción in vitro se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en inmunología. En tanto, los retinoides son moléculas que han mostrado participar en procesos de diferenciación celular en diversos tejidos, siendo producidos por una variedad de células, incluidas las DCs. Se ha descrito que miembros de la familia de las aldehído deshidrogenasas (ALDH), son responsables de catalizar la oxidación irreversible de retinoides tales como el retinal a ácido retinoico. Los objetivos de esta memoria fueron: Estudiar las diferencias de expresión de marcadores de diferenciación en cultivos normales y cultivos mantenidos con el inhibidor dietilaminobenzaldehido (DEAB), específico de ALDHs; evaluar la acción de DEAB en cultivos diferenciados por una vía independiente de la enzima; definir si la adición del inhibidor tiene repercusiones en la viabilidad y funcionalidad normal de las DCs, y evaluar la expresión de mRNA y la actividad enzimática de ALDHs en cultivos normales de diferenciación. Nuestros resultados indican que DCs generadas en presencia de DEAB muestran una expresión significativamente menor del marcador de superficie CD11c, mientras el marcador CD14 se expresa en niveles más elevados que en las DCs generadas en condiciones normales. La adición de DEAB a cultivos independientes de la enzima no tuvo efecto alguno en la diferenciación celular. La cantidad de células muertas para todas las condiciones de experimentación es invariable y funcionalmente las células mantenidas con DEAB presentan características propias de deprivación de retinoides. x También se pudo demostrar diferencias en la expresión de isoenzimas de ALDHs a distintos días de diferenciación, al igual que en los niveles de actividad enzimática. Concluimos que las enzimas retinal deshidrogenasas cumplen un rol muy importante en la generación de células dendríticas humanas in vitro.

Existen genes que, según las variantes que se presentan en la naturaleza,pueden ser permisivos o protectores frente al alcoholismo. El gen ALDH2 eshabitualmente permisivo (alelo ALDH2*1) porque codifica la enzimadeshidrogenasa aldehídica mitocondrial la cual cataliza la oxidación delacetaldehído a acetato en la vía degradativa del etanol. Este gen tiene unsegundo alelo protector, ALDH2*2, que da origen a una enzima inactiva,impidiendo la oxidación del acetaldehído y desencadenando en los individuosportadores un aumento en los niveles plasmáticos de acetaldehído de hasta 20veces sobre lo normal. Estos individuos sienten malestares físicos comomareos, taquicardia y náuseas al consumir alcohol lo que les provoca unaaversión frente al consumo. Siendo el alelo ALDH2*2 un gen protector frente al alcoholismo, producir una disminución de la actividad enzimática es una buena estrategia terapéutica frente a la enfermedad. Un tratamiento farmacológico habitual para el alcoholismo es generar una aversión al consumo de alcohol con disulfiram. Este fármaco inactiva eficazmente la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2), pero es muy tóxico. Una alternativa terapéutica es imitar el efecto del disulfiram silenciando el mRNA de la ALDH2 con ribozimas, RNAs catalíticos pequeños capaces de disminuir la síntesis proteica por ocupación y/o degradación del mRNA. Se ensayaron ribozimas de horquilla y martillo dirigidas hacia un mismo blanco del mRNA de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo, dado que el hígado es el órgano más importante en la degradación del etanol. Se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios portadores de genes de ribozimas y se midió la actividad de la ALDH2 espectrofotométricamente en extractos celulares. Se usaron ribozimas control para determinar posibles efectos de antisentido. La ribozima de horquilla (RzCG20), clonada en el vector pAC-CMV y codificada en un gen que posee el promotor del citomegalovirus y la señal de poliadenilación del virus SV40, disminuyó en 42 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células H4-II-E-C3, siendo el 44 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. En cambio, la ribozima de horquilla clonada en el vector pAAV-CMV y codificada en un gen cuya señal de poliadenilación es la de la hormona del crecimiento humana, disminuyó en 36 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células en cultivo, siendo el 64 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. La ribozima de martillo redujo sólo en 20% la actividad de la ALDH2, efecto dado exclusivamente por bloqueo del mRNA. Efectuando correcciones con el tiempo de vida media de la enzima se estima que el porcentaje de disminución del 42 % de la actividad de la ALDH2 es de al menos 56% al usar el gen de una ribozima de horquilla anti ALDH2. No se corrigió por el porcentaje de células H4-II-E-C3 transfectadas debido a la imposibilidad de obtener una estimación razonable usando el gen de la eGFP como reportero. Sin embargo, el porcentaje mínimo (56 %) concuerda con que en células 293 derivadas de riñón de embrión humano, cuyo porcentaje de transfección es cercano al 70 %, la ribozima disminuyó en 68 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 únicamente por acción antisentido. Buscando alcanzar un 100 % de transfección se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios derivados del pCEP4 codificantes de las ribozimas de horquilla y su control. Este vector, que otorga permanencia y segregación divisional, mostró efectos tóxicos sobre las células de manera que no se pudo evaluar el efecto de la ribozima de horquilla en un cultivo celular homogéneo. Los resultados de este trabajo de tesis muestran que la ribozima de horquilla RzCG20, dirigida a los nucleótidos 1553 a 1569 del mRNA de la ALDH2 de rata, es un buen candidato para experimentos in vivo enfocados hacia el desarrollo de un fármaco génico para el alcoholismo.