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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Lactato deshidrogenasa es una enzima que clásicamente se ha descrito como citoplasmática. Pese a ello, algunos autores han aportado evidencia que sugiere la presencia de esta enzima en mitocondrias, lo que ha generado controversia respecto a su localización subcelular. Con el ánimo de aportar información que permita comprender el funcionamiento de la vía indirecta de síntesis de glicógeno en oocitos de rana, se decidió estudiar la localización de la enzima así como algunas de sus características. Para determinar la localización subcelular se compararon los resultados obtenidos de actividad de LDH con los resultados de actividad de enzimas marcadoras de fracción citoplasmática y mitocondrial en fracciones subcelulares obtenidas por centrifugación diferencial de extractos de oocitos de rana. La caracterización parcial de la enzima se realizó determinando los valores de Km para los sustratos, el pH óptimo de actividad de la enzima y el peso molecular nativo mediante cromatografía de exclusión molecular y el peso molecular de la subunidad por electroforesis desnaturante en geles de poliacrilamida (PAGE). Además, se observó la existencia de isoformas mediante cromatografía de intercambio iónico y electroforesis nativa en geles de poliacrilamida. Se determinó que lactato deshidrogenasa está presente en la fracción citoplasmática de los oocitos de rana y que está ausente en la fracción mitocondrial. Se caracterizaron las dos fracciones obtenidas mediante cromatografía de intercambio iónico observando una gran similitud en las características cinéticas de la enzima presente en cada fracción. Se calculó el peso molecular nativo de 131 KDa mediante cromatografía de filtración en gel y el peso molecular de la subunidad de la enzima de 33 KDa mediante electroforesis desnaturante. Se determinó la presencia de dos isoformas de la enzima mediante cromatografía de intercambio iónico.

La formaldehído deshidrogenasa dependiente de glutatión (FALDH) (EC 1.2.1.1), conocida también como ADH clase III, es un enzima ubícuo, presente en el reino vegetal y animal. La eliminación del formaldehído dentro de la célula se realiza principalmente mediante la FALDH, que utiliza NAD+ como cofactor. El formaldehído es un intermediario del metabolismo celular normal, aunque puede tener también un origen exógeno, siendo un polucionante atmosférico y de aguas residuales. Por otra parte, el formaldehído se forma intracelularmente durante la peroxidación lipídica en situaciones de estrés oxidativo. La eliminación de este formaldehído, que es muy tóxico para la célula, es necesaria para su supervivencia.Recientemente se ha descubierto que la FALDH tiene también actividad S-nitrosoglutatión reductasa. El S-nitrosoglutatión (GSNO) es uno de los más abundantes metabolitos endógenos del oxido nítrico (NO), que actúa como uno de los señalizadores moleculares en los mecanismos de defensa de las plantas.En esta Tesis Doctoral hemos demostrado que la expresión de la FALDH está regulada por herida y por diferentes hormonas vegetales, tales como el ácido jasmónico y el ácido salicílico. También hemos generado plantas transgénicas de A. thaliana portadoras de una construcción antisentido, que presenta una importante disminución de la actividad enzimática FALDH, directamente relacionados con los niveles de proteína. Dichas plantas transgénicas tienen una menor capacidad de metabolizar formaldehído exógeno y presentan un aumento de la resistencia basal a patógenos fúngicos y bacterianos. Por otra parte, las plantas transgénicas con niveles de FALDH modificados (tanto las antisentido como las de sobreexpresión) muestran un fenotipo diferente, principalmente en la raíz. La inmunolocalización en tejidos reveló que la FALDH presenta un patrón de expresión en hojas y en raíz que es específico del tipo celular. A nivel subcelular, la FALDH está presente en citoplasma, núcleo y cloroplasto. Esta es la primera vez que se describe la localización cloroplástica de la FALDH. / The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (FALDH) is the main enzyme of the formaldehyde detoxification system in eukaryotes. In Arabidopsis, it is coded by a single gene, which is constitutively expressed. To gain more insight into the functional role of this enzyme in plants, we have studied the spatial distribution of the enzyme at cellular and subcellular level. By immunolocalization experiments on root and leaf sections we have demonstrate that the pattern of expression of the enzyme is cell specific. At subcellular level, FALDH localizes in cytoplasm, nucleus and chloroplasts. We have demonstrated that Arabidopsis plants with reduced levels of FALDH, bearing antisense constructs, show a slower rate in formaldehyde elimination. These results confirm the central role of FALDH in formaldehyde metabolism in plants and have important implications in the phytoremediation of environmental formaldehyde. We observed also that the antisense transgenics lines were more resistance to the infection with pathogens (bacteria and fungus).The importance of FALDH has been greatly increased by the discovery of its potent activity toward S-nitrosoglutathione, the condensation product of glutathione and nitric oxide (NO). NO and NO-related metabolites, such as S-nitrosothiols (SNOs) play a central role in signal transduction and host defense. We have investigated the gene response to mechanical wounding and plant hormones involved in signal transduction, showing that the gene is down-regulated by wounding in a JA-dependent pathway, and that it is transcriptionally activated by salicylic acid. This is the first time that regulation of FALDH in response to signals associated with plant defense has been demonstrated.

Gracias a la resurrección de varias enzimas de nuestros antepasados primates se han identificado varias mutaciones que ocurrieron hace, aproximadamente, 10 millones de años, las cuales le confirieron a nuestros antepasados una capacidad mucho mayor para metabolizar etanol. Este episodio de evolución enzimática coincidió con un cambio climático global asociado con la reducción de los bosques africanos y la transición de nuestros antepasados de un estilo de vida arbórea a un estilo de vida terrestre en el cual la fruta altamente fermentada era más común. Estos estudios sugieren que la evolución de las enzimas de nuestros antepasados pueden haberles permitido explotar una fuente alternativa de alimento cuando la comida era escasa. / We have resurrected ancient enzymes from our primate ancestors and identified several mutations occurring approximately 10 million years ago that endowed our ancestors with an enhanced capacity to metabolize ethanol.  This episode of enzyme evolution coincided with a global climate change associated with shrinking African forests and our ancestor’s transition from an arboreal lifestyle to a terrestrial lifestyle where highly fermented fruit is more common. These studies suggest that the evolution of our ancestor’s enzymes may have enabled our ancestors to exploit an alternative source of nourishment during a time when food was scarce.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El riesgo individual de alcoholismo tiene un componente hereditario de 40 a 60%. Los únicos factores genéticos bien establecidos para una susceptibilidad diferenciada al alcoholismo son polimorfismos en los genes de las principales enzimas del metabolismo del etanol, la deshidrogenasa alcohólica (ADH) y la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). Las variantes polimórficas de estas enzimas difieren en sus propiedades catalíticas y en sus distribuciones étnicas. El etanol es metabolizado en el hígado a acetaldehído por la ADH y luego a acetato por la ALDH2. En portadores de una ALDH2 inactiva (ALDH2*2) el acetaldehído, en lugar de degradarse, se acumula en el cuerpo produciendo reacciones desagradables que evitan una ingesta excesiva de alcohol. Se postula que los portadores de las variantes rápidas de la ADH (ADH1C1, ADH1B2) también experimentan un alza de acetaldehído corporal luego de consumir etanol, teniendo así una protección genética contra el alcoholismo. En contraste, los portadores de las ADHs lentas (ADH1C2 o ADH1B1) o de la ALDH2 de gran actividad (ALDH2*1) tienen un mayor riesgo de alcoholismo. La variante inactiva de la ALDH2 (ALDH2*2) es exclusiva de la población del este de Asia (40%), que tiene además frecuencias altas de los alelos protectores ADH1C*1 (90%) y ADH1B*2 (70%), mientras que las poblaciones caucásicas tienen frecuencias menores de estos alelos (50% y 5%, respectivamente). Para determinar si los alelos ADH1C*2 o ADH1B*1 de la deshidrogenasa alcohólica (ADHs lentas) aumentan el riesgo de alcoholismo en la población chilena se determinaron los genotipos de la ADH1C y la ADH1B en pacientes alcohólicos (n = 30) y población chilena general (n = 105). Se amplificaron segmentos específicos de estos genes utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se analizaron las variaciones codificantes de cambios aminoacídicos mediante digestión con enzimas de restricción, separando los fragmentos resultantes por tamaño mediante electroforesis (RFLP). Se evaluó la significación estadística de las diferencias encontradas entre los grupos en las frecuencias alélicas y genotípicas de los genes ADH1C y ADH1B. La frecuencia del alelo ADH1C*2 es significativamente mayor (p < 0,04) en pacientes alcohólicos (0,40) que en la población general (0,26), aumentando casi al doble el riesgo de alcoholismo (OR = 1,96) respecto del alelo ADH1C*1. La frecuencia genotípica de los homocigotos ADH1C*2/*2 es también mayor (p < 0,05) en pacientes alcohólicos (0,14) que en la población general (0,07), teniendo estos individuos un riesgo de alcoholismo casi cuatro veces mayor (OR = 3,85) que los homocigotos ADH1C*1/*1. Las frecuencias del alelo ADH1B*1 son prácticamente idénticas en ambos grupos (alrededor de 0,95), haciendo imposible determinar si éste aumenta el riesgo de alcoholismo en la población chilena, dado el tamaño muestral empleado. Se analizaron cinco variaciones nucleotídicas adicionales, lo que permitió encontrar en la población chilena una variante del alelo ADH1C*2 exclusiva de la población nativa de América (ADH1C*2Thr351) y describir por primera vez la existencia de dos variantes nuevas del alelo ADH1B*1. La variante ADH1B*1Ser59 incorpora un polimorfismo (A5226T) antes reportado aisladamente y la variante ADH1B*1Arg367 incorpora una mutación encontrada aquí (T15490G). No se encontró evidencia de que estas variantes modifiquen el riesgo de alcoholismo en la población chilena, pero sí se encontró una tendencia hacia un riesgo aumentado de alcoholismo para el alelo ADH1C*2Thr351, al compararlo con los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2 en conjunto. A partir de los resultados de esta memoria se pueden emitir tres conclusiones. (I) El alelo ADH1C*2 y el genotipo ADH1C*2/*2 aumentan el riesgo de alcoholismo en la población chilena respecto del alelo ADH1C*1 y el genotipo ADH1C*1/*1. (II) El genotipo de la ADH1C se puede determinar analizando sólo la posición nucleotídica 11939 (aa 271) y no la posición 15115 (aa 349), ya que sus identidades están perfectamente asociadas (11939A / 15115G y 11939G / 15115A) y porque el análisis de la posición nucleotídica 11939 tiene una mayor fortaleza en su diseño experimental por a) tener reacciones positivas para las dos identidades nucleotídicas (A y G) de esta posición y b) determinar un cambio aminoacídico de mayor importancia por encontrarse en el sitio activo de la enzima. (III) El genotipo de la ADH1B puede ser excluido del análisis del aumento del riesgo de alcoholismo conferido por las variantes lentas de la ADH en la población chilena porque su diferencia entre grupos es mínima.

Introducción: En febrero del 2016 fueron publicadas las nuevas recomendaciones para identificar al paciente con sepsis con la escala SOFA (Evaluación de la falla orgánica relacionada con la sepsis) y la nueva escala quick SOFA. Objetivo: Evaluar la utilidad de estas escalas como pronóstico de mortalidad en pacientes con sepsis hospitalizados en la unidad de cuidados intensivos (UCI) de la Clínica Good Hope de enero a diciembre del 2015, así como los factores asociados a su mortalidad. Material y métodos: Se revisaron las historias clínicas de los pacientes mayores de 18 años hospitalizados en UCI/UCIN con los diagnósticos de sepsis de acuerdo a su CIE-10. Se recabaron los datos epidemiológicos, clínicos y laboratoriales necesarios para aplicar las escalas SOFA y QSOFA. Se realizó estadística descriptiva, análisis bivariado y análisis del área bajo la curva COR. Resultados: El principal foco infeccioso fue el respiratorio (41.5%). Fallecieron 28.3% de los pacientes. Las variables creatinina y lactato sérico demostraron ser estadísticamente significativos con un OR=11.67(IC 95% 2.58-52.85, p=0.000) y OR=5.78 (IC95% 1.45-23.03, p=0.009), respectivamente. El AUC de SOFA fue 0.698, p=0.026, IC 95% (0.54-0.85), demostrando ser estadísticamente significativa. Se halló un punto de corte de 7.5 con una sensibilidad de 46.7% y 86.8% de especificidad. La escala QSOFA no demostró asociación estadísticamente significativa. Conclusiones: La escala SOFA fue efectiva para identificar aquellos pacientes con probabilidad de fallecer.

D.L. A 455-2007

CICYT (BIO-093-0600-C04-03); Generalitat Valenciana (GV-1170/93)

El presente trabajo ha sido subencionado en parte por los proyectos: BI093-0660-CO4-03 CICYT y GV-1170793 Generalitat Valenciana.

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