El primer que es va abordar en la present Tesi Doctoral va ser la determinació de l'estructura primària completa de l'alcohol deshidrogenasa humana de la classe IV, de la qual només se'n coneixien alguns fragments parcials obtinguts per anàlisi de pèptids, en col.laboració amb el grup del Prof. Hans Jörnvall, del Karolinska Institutet d'Estocolm. Es va optar, doncs, per la clonació del seu cDNA mitjançant el triatge d'una biblioteca, utilitzant com a sonda un fragment del cDNA de l'ADH4 de rata. Posteriorment, es va procedir a l'estudi de la rellevància funcional de la posició 294, que presenta una valina en la forma humana i una alanina en la de rata. Aquesta posició està situada en la regió intermèdia de la cavitat d'unió del substrat. Així, es va fer un treball paral.lel de mutagènesi dirigida d'aquest aminoàcid, realitzant substitucions recíproques en els dos enzims. En la present Tesi Doctoral, es va expressar en E. coli i es va obtenir el mutant Ala294Val. Es van caracteritzar l'enzim recombinant i el mutant amb etanol i retinoides. També es va desenvolupar un model molecular de l'estructura tridimensional de l'enzim ADH4 de rata i es van fer simulacions de la interacció de retinoides amb els dos enzims, mitjançant estudis de docking. D'altra banda, en el nostre grup es va identificar una forma present en la mucosa digestiva de l'amfibi Rana perezi, que mostrava analogies estructurals i funcionals amb els enzims ADH4 de mamífer. La determinació parcial de la seva seqüència d'aminoàcids va suggerir que aquesta forma d'alcohol deshidrogenasa era dependent de NADP(H) en lloc de NAD(H), degut a la substitució de l'aspàrtic 223 per glicina. Els estudis cinètics subsegüents van confirmar una especificitat de coenzim fins aleshores inèdita entre les alcohol deshidrogenases de vertebrat. Per a obtenir l'estructura primària completa d'aquest enzim es va procedir a la clonació del seu cDNA, utilitzant la PCR i estratègies d'amplificació dels extrems de cDNA. Prosseguint amb la determinació de la presència en altres espècies de formes d'ADH, es va estudiar el pollastre, com a espècie model de les aus. Es va identificar un enzim amb activitat alcohol deshidrogenasa i amb preferència per NADP(H), que s'expressava en el tracte digestiu superior i en ull. L'enzim responsable d'aquesta activitat va resultar ser una aldo_ceto reductasa, que presentava la peculiaritat de ser activa amb etanol i amb retinoides, un fet fins aquell moment mai observat en aquesta família. Es va clonar el cDNA de l'aldo_ceto reductasa i es va obtenir la seva seqüència completa. Es va estudiar el patró d'expressió del gen per transferència Northern. Es van obtenir les constants cinètiques de l'enzim amb diversos substrats, incloent retinoides. Per a estudiar la base estructural de les propietats de l'enzim, es va desenvolupar un model molecular i es van realitzar simulacions de docking. / Initially, in the present Doctoral Thesis, the primary structure of human alcohol dehydrogenase class IV (ADH4) was determined by screening of a cDNA library, and using a DNA fragment of rat ADH4.The function of position 294 in human and rat ADH4 was studied by site-directed mutagenesis. Position 294 is localized in the middle region of the substrate-binding pocket, and is occupied by a Valine in human ADH4 and an Alanine in rat ADH4, being this substitution the most significant difference between both enzymes. Rat ADH4 and rat Ala294Val mutant were kinetically characterized, with ethanol and all-trans, 9-cis and 13-cis retinoids. A molecular model of rat ADH4 was built, and docking studies with retinoid isomers were performed.On the other hand, in our group, an ADH from an amphibian species (Rana perezi) was characterized. This enzyme was kinetically similar to rat and human ADH4. However, this enzyme was NADP(H)-dependent, instead od NAD(H)-dependent like all other vertebrate ADHs. In the present Doctoral Thesis, the cDNA of the amphibian ADH (named ADH8) was obtained and the structural features that correlate with its distinct NADP(H) dependence were analyzed. Finally, the presence of an ADH homologous to human ADH4 or amphibian ADH NADP(H)-dependent was studied in an avian species (chicken, Gallus Domesticus). An enzyme NADP(H)-dependent, similar to amphibian ADH8, was characterized. However, the analysis of the primary structure revealed that this enzyme was not an ADH from the medium chain dehydrodrogenase/reductase superfamily. The ADH characterized from chicken tissues was an aldo-keto reductase, an enzyme from a completely different family. Chicken AKR was unique in all AKR superfamily because it was able to use ethanol and retinoids as substrates.

Se ha abordado el estudio detallado de la localización de distintas formas de alcohol deshidrogenasa (ADH) en tejidos de rata y, en particular, en el sistema vascular, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central y tejidos oculares. Se han estudiado esencialmente ADH1 y ADH4, que son los enzimas más relevantes en la oxidación de etanol a acetaldehído, y en la oxidación de retinol a retinal en la vía de síntesis del ácido retinoico.ADH4 se detectó como la forma principal en los vasos sanguíneos de la rata, mientras que en los vasos humanos ADH1B era el enzima predominante. Tanto ADH1 como ADH4, se han detectado a lo largo de todo el tracto gastrointestinal, principalmente en la mucosa, variando su cantidad relativa y su ubicación celular en función del área estudiada. ADH4 es más abundante en las partes más externas del tracto (boca, esófago, colon y recto), mientras que ADH1 es la forma mayoritaria en el intestino. En el cerebro, mediante hibridación in situ, ambas formas de ADH se han localizado en el cerebelo, formación hipocampal y áreas muy concretas de la corteza cerebral, mostrando colocalización en algunos tipos celulares y una expresión específica en otros. La inmunodetección de ADH4 en homogeneizados de diferentes regiones cerebrales ha confirmado la presencia de la proteína en áreas concretas del SNC donde también se ha localizado su mRNA. Ambas clases han sido también detectadas en el sistema ventricular y vascular asociado al SNC. En los tejidos oculares, la proteína ADH4 se ha localizado en la coroides, cuerpo ciliar, nervio óptico y en capas concretas de la córnea y retina.Finalmente, se ha comparado el patrón de expresión ADH en tejido hepático con el de una línea celular de hepatocarcinoma. La línea de hepatocarcinoma de rata H4IIEC3 mostró la expresión de ADH1 y ADH3, presentes en hígado normal, y, además, ADH4, ausente en hígado. Se investigó el efecto del ácido retinoico sobre la expresión de cada una de las tres formas de ADH. Se ha observado un aumento de los niveles de mRNA de ADH1 y un descenso de los de ADH4, mientras que los niveles de mRNA de ADH3 se mantuvieron constantes.La distribución de ADH1 y ADH4, junto con sus propiedades cinéticas y su regulación, permiten inferir algunas de sus funciones fisiológicas en el metabolismo del etanol y de los retinoides, la reducción de aldehídos citotóxicos derivados de la peroxidación lipídica, el catabolismo de las catecolaminas, etc. Asimismo, el metabolismo endógeno de etanol, proporciona una base molecular para comprender las alteraciones causadas por el abuso del alcohol en determinados órganos y tejidos. En este sentido, proponemos la hipótesis de que algunos de los efectos tóxicos del etanol podrían explicarse por la interferencia, a nivel de la ADH, con la vía de síntesis del ácido retinoico.

L'àcid retinoic, en les seves formes tot-trans- i 9-cis-, actua com a lligand de receptors nuclears específics, i és essencial en processos de creixement, desenvolupament i manteniment epitelial. La via de formació de l'àcid retinoic inclou dos pasos d'oxidació, de retinol a retinal i de retinal a àcid retinoic. S'han descrit diversos enzims que poden participar en el primer pas, com les ADH i les RDH, però es desconeix la contribució de cada enzim en el procés.S'han clonat, expressat i purificat ADH1B1, ADH2B2 i ADH4 humanes, i també ADH1 i ADH4 de ratolí que, per primera vegada, s'han caracteritzat en la seva forma recombinant. S'han determinat les constants cinètiques de totes aquestes ADHs amb tot-trans- i 7-cis-, 9-cis-, 11-cis- i 13-cis-retinol i els corresponents retinals. En general, les ADH4 humana i de ratolí mostren constants cinètiques similars, i són més eficients que les ADH1. Totes les ADHs utilitzen com a substrats tant 11-cis-retinol com 11-cis-retinal, compostos rellevants en el cicle visual. S'ha observat que l'ADH4 mostra especificitat per a l'oxidació d'11-cis-retinol sobre la reducció d'11-cis-retinal, una propietat única entre totes les ADHs per a qualsevol parella de substrats alcohol/aldehid. Mitjançant mètodes de simulació molecular, i clonatge, expressió i caracterització del mutant de l'ADH4 humana M141L, hem demostrat que el residu 141, situat a la regió mitjana del túnel hidrofòbic del seti actiu de l'ADH, és essencial per definir aquesta especificitat de l'ADH4 sobre les ADH1. La immunolocalització de l'ADH4 a l'epiteli pigmentat i en moltes capes de la retina, dóna suport a la participació de l'ADH4 en diferents reaccions amb retinoides. L'activitat citosòlica de l'ADH4 en l'epiteli pigmentat pot ser complementària a l'activitat 11-cis-retinol deshidrogenasa de la RDH5, necessària per completar el cicle visual, i pot estar també implicada en la generació d'àcid retinoic a les capes neuronals de la retina.Una altra família de retinoides està constituïda per derivats oxidats en l'anell ciclohexè, com per exemple els 4-oxo-, 4-hidroxi- i 3,4-dideshidroretinol i els corresponents retinals. Tot i que són compostos poc estudiats, es coneix que alguns derivats, com els àcids 4-oxo- i el 3,4-dideshidroretinoic poden interaccionar amb receptors nuclears. Les cinètiques dels enzims ADH1B1, ADH2B2 i ADH4 humanes, i també ADH1 i ADH4 de ratolí, indiquen que el 4-oxo-retinal i el 4-hidroxi-retinol són els substrats amb una eficiència catalítica més alta d'entre tots els retinoides, especialment pel que fa a les ADH4, mentre que els 3,4-dideshidroretinoides presenten una activitat similar a la dels tot-trans-retinoides. Les dades obtingudes in vitro recolzen l'existència d'una via metabòlica per a la formació dels àcids retinoics oxidats en l'anell a partir dels corresponents retinols, amb la participació de l'ADH. Finalment, hem comprovat que la presència de Tween 80 provoca una disminució de l'activitat que resulta en una aparent inhibició competitiva en les cinètiques de l'ADH per al tot-trans-retinol, amb un augment de la Km i disminució de l'eficiència catalítica en augmentar la concentració del detergent. Això implica que els valors reals de Km són molt inferiors als publicats fins ara, tradicionalment obtinguts en presència de 0,02 % de Tween 80. Així, les ADHs presenten valors de Km pròxims als de les RDHs i, per tant, la contribució al metabolisme dels retinoides podria ser similar per a ambdós sistemes enzimàtics. Hem comprovat, espectrofotomètricament i per HPLC, que el Tween 80 manté l'estabilitat de la solució aquosa de retinoides, i que permet obtenir resultats reproduïbles i comparables entre diferents ADHs. / Studies in knockout mice support the involvement of alcohol dehydrogenases ADH1 and ADH4 in retinoid metabolism, although kinetics with retinoids are not known for the mouse enzymes. Moreover, a role of ADH in the eye retinoid interconversions cannot be ascertained due to the lack of information on the kinetics with 11-cis-retinoids. We report here the kinetics of human ADH1B1, ADH1B2, ADH4, and mouse ADH1 and ADH4 with all-trans-, 7-cis-, 9-cis-, 11-cis-, and 13-cis-isomers of retinol and retinal. These retinoids are substrates for all enzymes tested, except the 13-cis isomers which are not used by ADH1. In general human and mouse ADH4 exhibit similar activity, higher than that of ADH1, while mouse ADH1 is more efficient than the homologous human enzymes. All tested ADHs use 11-cis-retinoids efficiently. ADH4 shows much higher kcat/Km values for 11-cis-retinol oxidation than for 11-cis-retinal reduction, a unique property among mammalian ADHs for any alcohol/aldehyde substrate pair. Docking simulations and the kinetic properties of the human ADH4 M141L mutant demonstrated that residue 141, in the middle region of the active site, is essential for such ADH4 specificity. The distinct kinetics of ADH4 with 11-cis-retinol, its wide specificity with retinol isomers and its immunolocalization in several retinal cell layers, including pigment epithelium, support a role of this enzyme in the various retinol oxidations that occur in retina. Cytosolic ADH4 activity may complement the isomer-specific microsomal enzymes involved in photopigment regeneration and retinoic acid synthesis.On the other hand, alcohol dehydrogenases (ADH1 and ADH4) actively use retinoids oxidized at the cyclohexenyl ring (4-oxo-, 4-hydroxy- and 3,4-didehydro-retinoids), which are functional compounds in several cells and tissues (i.e. in human skin). Remarkably, activities with 4-oxo-retinal and 4-hydroxy-retinol (kcat = 2050 min-1 for ADH4) are the highest among retinoids, similar to those of the best aliphatic alcohols. Thus, ADH1 and ADH4 provide a metabolic pathway for the synthesis of the corresponding retinoic acids.Finally, Tween 80, a widely used detergent in the retinoid activity assay, behaves as a competitive inhibitor. The Km values for all-trans-retinol (2-3 M), estimated in the absence of detergent, are 10-fold lower than those obtained at the usual 0.02% Tween 80. This suggests a contribution of ADH in retinoid metabolism more relevant than previously expected. However, Tween 80 stabilizes retinoids in water solution and provides a reliable and reproducible assay, suitable for comparing different ADHs and different retinoid substrates.

Gracias a la resurrección de varias enzimas de nuestros antepasados primates se han identificado varias mutaciones que ocurrieron hace, aproximadamente, 10 millones de años, las cuales le confirieron a nuestros antepasados una capacidad mucho mayor para metabolizar etanol. Este episodio de evolución enzimática coincidió con un cambio climático global asociado con la reducción de los bosques africanos y la transición de nuestros antepasados de un estilo de vida arbórea a un estilo de vida terrestre en el cual la fruta altamente fermentada era más común. Estos estudios sugieren que la evolución de las enzimas de nuestros antepasados pueden haberles permitido explotar una fuente alternativa de alimento cuando la comida era escasa. / We have resurrected ancient enzymes from our primate ancestors and identified several mutations occurring approximately 10 million years ago that endowed our ancestors with an enhanced capacity to metabolize ethanol.  This episode of enzyme evolution coincided with a global climate change associated with shrinking African forests and our ancestor’s transition from an arboreal lifestyle to a terrestrial lifestyle where highly fermented fruit is more common. These studies suggest that the evolution of our ancestor’s enzymes may have enabled our ancestors to exploit an alternative source of nourishment during a time when food was scarce.

[EN] Mutants able to germinate and perform early growth in medium containing a high NaCl concentration were identified and named salt resistant (sre). The sre mutants also were able to germinate in high-osmoticum medium, indicating that they are osmotolerant in a germination assay. Complementation analyses revealed that sre1-1 and sre1-2 were alleles of the abscisic acid (ABA) biosynthesis ABA2 gene. A map-based cloning strategy allowed the identification of the ABA2 gene and molecular characterization of the new aba2 alleles. The ABA2 gene product belongs to the family of short-chain dehydrogenases/reductases, which are known to be NAD- or NADP-dependent oxidoreductases. Recombinant ABA2 protein produced in Escherichia coli exhibits a Km value for xanthoxin of 19 µM and catalyzes in a NAD-dependent manner the conversion of xanthoxin to abscisic aldehyde, as determined by HPLC-mass spectrometry. The ABA2 mRNA is expressed constitutively in all plant organs examined and is not upregulated in response to osmotic stress. The results of this work are discussed in the context of previous genetic and biochemical evidence regarding ABA biosynthesis, confirming the xanthoxin-->abscisic aldehyde-->ABA transition as the last steps of the major ABA biosynthetic pathway. The abscisic aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product of A. thaliana catalyzes the final step in abscisic acid (ABA) biosynthesis. An aao3-1 mutant in a Landsberg erecta genetic background exhibited a wilty phenotype in rosette leaves, whereas seed dormancy was not affected (Seo et al., 2000a). Therefore, it was speculated that a different aldehyde oxidase would be the major contributor to ABA biosynthesis in seeds (Seo et al., 2000a). Through a screening based on germination under high-salt concentration, we isolated two mutants in a Columbia genetic background, initially named sre2-1 and sre2-2. Complementation tests with different ABA-deficient mutants indicated that sre2-1 and sre2- 2 mutants were allelic to aao3-1, and therefore they were renamed as aao3-2 and aao3-3, respectively. Indeed, molecular characterization of the aao3-2 mutant revealed a T-DNA insertional mutation that abolished the transcription of AAO3 gene, while sequence analysis of AAO3 in aao3-3 mutant revealed a deletion of three nucleotides and several missense mutations. Physiological characterization of aao3-2 and aao3-3 mutants revealed a wilty phenotype and osmotolerance in germination assays. In contrast to aao3-1, both aao3-2 and aao3-3 mutants showed a reduced dormancy. Accordingly, ABA levels were reduced in dry seeds and rosette leaves of both aao3-2 and aao3-3. Taken together, these results indicate that AAO3 gene product plays a major role in seed ABA biosynthesis. / [ES] El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona implicada en el control de procesos vegetales esenciales, principalmente el desarrollo de la semilla así como la respuesta de las plantas a diferentes estreses ambientales, particularmente frío, sequía y salinidad. En el presente trabajo se ha realizado la búsqueda en colecciones de Arabidopsis thaliana mutagenizadas con T-DNA de mutantes capaces de germinar en condiciones de alta sal (NaCl), identificándose tres loci mutantes, inicialmente denominados sre1, sre2 y sre3 (“salt resistant”). Los mutantes sre, además de su capacidad para germinar y establecer plántula en condiciones de estrés osmótico, mostraban una germinación resistente a paclobutrazol, latencia muy reducida, mayor transpiración y niveles de ABA en hojas de roseta significativamente menores que plantas silvestres. El análisis de complementación reveló que los mutantes sre1 eran alélicos al mutante aba2-1, los mutante sre2 eran alélicos al mutante aao3-1 y el mutante sre3 era alélico al mutante aba1-5. Así, el ABA bloquea la germinación y el establecimiento de la plántula en condiciones de bajo potencial hídrico, por lo que mutantes capaces de germinar en condiciones de estrés osmótico representan frecuentemente mutantes defectivos en la biosíntesis de ABA. Mediante una combinación de las estrategias de mapeo posicional y gen candidato se llevó a cabo la identificación del gen ABA2 y de las mutaciones sre1-1/aba2-11 y sre1- 2/aba2-12. El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena corta dependiente de NAD+ (SDR). La mutación sre1-1/aba2-11 es debida a una deleción de 53 pb que también supone un cambio en la pauta de lectura, generando un alelo nulo de ABA2. La mutación sre1-2/aba2-12 conduce a la sustitución Gly28Arg, afectando al sitio de unión del coenzima. Mediante un análisis HPLC-MS se ha demostrado que la proteína recombinante ABA2 cataliza la conversión de xantoxina en aldehído abscísico en una reacción dependiente de NAD+ . Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen inequívocamente que la conversión de xantoxina en aldehído abscísico representa el penúltimo paso de la ruta de biosíntesis de ABA y que este es catalizado por el producto génico del gen ABA2 (At1g52340). El último paso de la ruta de biosíntesis de ABA es la conversión de aldehído abscísico en ácido abscísico. Este paso está catalizado en Arabidopsis por el producto génico del gen AAO3. Los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutante aao3-1, muestran una reducción en los niveles de ABA en hojas de roseta y una mayor transpiración que las plantas silvestres. Además, y contrariamente el mutante aao3-1, muestran un fenotipo de osmotolerancia en germinación y establecimiento de plántula, germinación resistente a paclobutrazol, latencia reducida y poseen una reducción del 65% en los niveles de ABA en semillas. La caracterización molecular de la mutación sre2-1/aao3-2 revela una inserción de T-DNA que elimina la transcripción del gen AAO3, constituyendo por tanto un alelo nulo. La secuenciación del gen AAO3 en el mutante sre2-2/aao3-3 revela una deleción de tres nucleótidos y varias mutaciones de cambio de sentido. La evidencia genética y bioquímica resultante del análisis de los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aaao3-3 indica que lesiones en el gen AAO3 conducen a niveles reducidos de ABA y fenotipos característicos en semillas. Por consiguiente, queda demostrado que el gen AAO3 desempeña un papel crucial en la biosíntesis de ABA en semillas. / [CA] L´àcid abscísic (ABA) és una fitohormona que ha estat implicada en el control de processos vegetals essencials, principalment en el desenvolupament de la llavor així com en la resposta de les plantes a diferents estressos ambientals, particularment fred, sequera i salinitat. En el present treball de tesi doctoral s´ha fet la recerca en coleccions d´Arabidopsis thaliana mutagenizades amb T-DNA de mutants capaços de germinar en condicions d´elevada sal (NaCl), identificant-se tres loci mutants, inicialment denominats sre1,sre2 i sre3 (“salt resistant”). Els mutants sre, a més de la seva capacitat per a germinar i establir plàntula en condicions d´estrès osmòtic, mostraven una germinació resistent a paclobutrazol, latència molt reduïda, major transpiració i nivells d´ABA en fulles de roseta significativament menors que les plantes silvestres. L´anàlisi de complementació va mostrar que els mutants sre1 eren al·lèlics al mutant aba2-1, els mutants sre2 eren al·lèlics al mutant aao3-1 i el mutant sre3 era al·lèlic al mutant aba1-5. Així, l´ABA bloqueja la germinació i l´establiment de la plàntula en condicions de baix potencial hídric, i aleshores mutants capaços de germinar en condicions d´estrès osmòtic representen normalment mutants amb defectes en la biosíntesi d´ABA. Mitjançant una combinació de les estratègies de mapeig posicional i gen candidat s´ha realitzat la identificació del gen ABA2 y de les mutacions sre1-1/aba2- 11 y sre1-2/aba2-12.El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena curta dependent de NAD+ (SDR). La mutació sre1-1/aba2-11 es deguda a una deleció de 53 pb que també suposa un camvi en la pauta de lectura, generant un al·lel nul de ABA2. La mutació sre1-2/aba2-12 produeix a la substitució Gly28Arg, afectant al lloc d´unió del coenzima. Mitjançant un anàlisi HPLC-MS s´ha demostrat que la proteïna recombinant ABA2 catalitza la conversió de xantoxina en aldehid abscísic en una reacció dependent de NAD+ . Els resultats obtinguts en el present treball estableixen inequívocament que la conversió de xantoxina en aldehíd abscísic representa el penúltim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA i que està catalitzat pel producte gènic del gen ABA2 (At1g52340). L´últim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA és la conversió de l´aldehid abscísic en àcid abscísic. Aquest pas està catalitzat en A. thaliana pel producte gènic del gen AAO3. Els mutants sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutant aao3-1, mostraven una reducció en els nivells d´ABA en fulles de roseta i una major transpiració que las plantes silvestres. A més, i contràriament al mutant aao3-1, mostraven un fenotip de osmotolerancia en germinació i establiment de plàntula, germinació resistent a paclobutrazol, latència reduïda i posseeixen una reducció del 65% en els nivells d´ABA en llavors. La caracterització molecular de la mutació sre2-1/aao3-2 revela una inserció de T-DNA que elimina la transcripció del gen AAO3, constituint por tant un al·lel nul. La secuenciació del gen AAO3 en el mutant sre2-2/aao3-3 va revelar una deleció de tres nucleòtids i vàries mutacions de canvi de sentit. L´evidencia genètica i bioquímica resultant de l´anàlisi dels mutants sre2- 1/aao3-2 i sre2-2/aaao3-3 indica que lesions en el gen AAO3 condueixen a nivells reduïts d´ABA i fenotips característics en llavors. Aleshores, queda demostrat que el gen AAO3 poseeix un paper crucial en la biosíntesi d´ABA en llavors. / González Guzmán, M. (2005). Genética molecular de la biosíntesis del ácido abscísico. Clonación y caracterización del gen ABA2 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/135830 / Premios Extraordinarios de tesis doctorales