Determina la eficacia de las pruebas DELI y MSF para calcular la IC50 de drogas antimaláricas mefloquina, quinina y cloroquina obtenidas de aislamientos de P. falciparum provenientes de pobladores de la comunidad de Padre Cocha en Iquitos-Perú. Se realizó un estudio cuantitativo descriptivo, prospectivo de corte transversal. La muestra fueron 16 muestras de sangre con diagnóstico de malaria confirmado por gota gruesa. Se realizaron los dos ensayos de sensibilidad in vitro (DELI y MSF) a cada muestra. Se determinaron tres factores de eficacia para el presente estudio; porcentaje de éxito, coeficiente de determinación de curva (R2) y coeficiente de variación (CV). Se hizo un análisis descriptivo y estadístico de los factores de eficacia mediante las pruebas de Wilcoxon y McNemar- Bowker para muestras pareadas con p < 0.05. Las medias aritméticas de los valores de IC50 con el ensayo DELI fueron para cloroquina 231.26 nM, quinina 101.17 nM y mefloquina 16.03 nM. Las medias de los valores de IC50 con el ensayo MSF fueron para cloroquina 227.52 nM, quinina 142.46 nM y mefloquina 35.07 nM. El porcentaje de éxito del cálculo de la IC50 para las tres drogas fueron el 50% (8/16) y 87.5% (14/16) en los ensayos MSF y DELI respectivamente, estas diferencias fueron estadísticamente significativas (p < 0.05). Sin embargo, en el análisis entre los porcentajes de éxito entre drogas, no presentaron diferencias para CQ y QN y si presentaron diferencias para MQ (p < 0.05). No hay diferencias significativas entre los valores de R2 entre las pruebas MSF y DELI. El porcentaje de éxito de CV positivos aumentó de 37.5% con el ensayo MSF a 81.25% con el ensayo DELI, estas diferencias fueron significativas (p < 0.05). Se concluye que el ensayo DELI es más eficaz que el ensayo MSF para calcular la IC50 de las drogas CQ, QN Y MQ. / Tesis

El tracte gastrointestinal de l’individu humà es troba colonitzat per la microbiota intestinal. L’epiteli intestinal actua com a barrera física per impedir que els bacteris accedeixin a òrgans essencials, i representa la superfície on l’hoste pot interaccionar amb el bacteri. Independentment de si el balanç final d’aquesta interacció és positiu o negatiu, la gran pressió selectiva que té lloc en la interfase bacteri-hoste determina que ambdues parts hagin desenvolupat múltiples maneres de comunicar-se. En aquest treball s’han abordat dos aspectes relacionats amb la interacció bacteri-hoste. Per una banda, com a model d’adaptació metabòlica durant l’adhesió d’Escherichia coli a enteròcits, s’ha estudiat la regulació de l’operó lldPRD. Per altra banda, s’ha aprofundit en l’estudi dels mecanismes de secreció de la proteïna multifuncional gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) de soques patògenes i probiòtiques com a mecanisme que el bacteri utilitza per interaccionar amb l’hoste. En referència a l’adaptació metabòlica d’E. coli durant l’adhesió, s’ha seleccionat un dels gens sobreexpressats en E. coli enterohemorràgica (EHEC) adherida a membranes plasmàtiques d’eritròcits, el gen lldR (Dahan i col, 2004). lldR codifica la proteïna reguladora de l’operó lldPRD, responsable del metabolisme d’L-lactat en E. coli, però no es tenen evidències experimentals sobre la regulació d’aquest operó. En aquesta tesi s’ha assignat a LldR un paper dual com a activador de la transcripció en presència d’L-lactat en el medi, i com a repressor en absència d’aquest, a través de la formació d’un bucle de DNA format mitjançant la unió d’LldR a dues seqüències operadores. El fet que l’operó lldPRD, estigui sobreexpressat en bacteris adherits podria representar un mecanisme pel qual el bacteri s’adapta a l’augment local de la concentració d’L-lactat a la superfície intestinal, contribuint a l’establiment d’una relació entre l’enterobacteri i l’a cèl·lula hoste. Pel que fa als mecanismes de secreció i interaccions de la GAPDH bacteriana amb l’hoste, prèviament s’havia identificat aquesta proteïna com a secretada per soques patògenes EHEC i EPEC (E. coli enteropatògena) crescudes en determinats medis de cultiu. En el present treball s’ha determinat la participació de dos mecanismes de secreció alternatius, el de tipus injectisoma (T3aSS), actiu en soques patògenes en medi de cultiu eucariota, i un altre mecanisme encara per identificar, actiu en soques patògenes i probiòtiques (E. coli Nissle 1917) en medi de cultiu bacteriològic ric. No es detecta secreció de GAPDH en soques aïllades naturals no patògenes com EcoR26, indicant que la secreció i/o exposició de la proteïna a la superfície representa un avantatge pels bacteris patògens i probiòtics en termes d’adhesió i colonització. Així, s’ha determinat la capacitat d’unió de la GAPDH a fibrinogen i plasminogen. Addicionalment, la GAPDH pot tenir altres funcions en la relació amb l’hoste. En aquest estudi s’ha determinat la capacitat de la GAPDH de ser internalitzada en la cèl·lula eucariota en forma de vesícules. També és possible que la proteïna sigui translocada al citoplasma de la cèl·lula hoste a través del T3SS. En aquest treball, s’ha observat la interacció de GAPDH amb els factors d’elongació de la traducció EF1Bγ i EF1Bα de l’enteròcit. Finalment, en aquest estudi s’ha comprovat la capacitat de la proteïna GAPDH de ser ADP-ribosilada. La GAPDH, però, també té activitat ADPribosiltransferasa, fet que podria determinar la seva participació en la modificació de proteïnes de l’hoste en el cas de ser translocada al citoplasma de la cèl·lula eucariota. En el context de la comunicació o diàleg entre el bacteri i l’hoste colonitzat, els resultats d’aquest treball ajuden a entendre alguns dels mecanismes pels quals les soques d’E. coli patògenes i/o probiòtiques s’adapten a l’entorn intestinal i s’adhereixen a l’epiteli més eficaçment que els bacteris que no presenten aquests mecanismes. / Human gastrointestinal tract is colonized by intestinal microbiota. The intestinal epithelium acts as a physical barrier and represents the area where host-bacteria interaction occurs. The selective pressure in this interface determines that both parties have developed many ways to communicate. In this work we have addressed two aspects of host-bacteria interaction. As a model for metabolic adaptation of Escherichia coli adherence to enterocyte, we have studied the regulation of lldPRD operon. As a mechanism that bacteria use to interact with the host, we have analysed the secretion mechanisms of the multifunctional protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of pathogenic and probiotic strains. lldR encodes the regulator protein of the lldPRD operon, which is responsible for the metabolism of L-lactate in E. coli. We have demonstrated that LldR plays a dual role as an activator of transcription of the operon in the presence of L-lactate, and as a repressor in absence of the inducer through the binding of LldR to two operator sequences and the formation of a DNA loop. The fact that the lldPRD operon is overexpressed in attached bacteria might be a mechanism used by bacteria to adapt to increased local concentration of L-lactate on the intestinal surface. We have determined the participation of two alternative mechanisms in bacterial GAPDH secretion. The T3SS injectisome is active in pathogenic strains growing in eukaryotic culture medium. Another mechanism is active in pathogenic and probiotic strains (E. coli Nissle 1917) growing in rich bacteriological medium. No secretion was detected in natural non-pathogenic isolates, indicating that secretion or exposure of the protein on the surface confers advantages to pathogenic and probiotic bacteria in terms of adhesion and colonization. We have also determined that GAPDH binds fibrinogen and plasminogen. Moreover, we have demonstrated that GAPDH possesses ADPrybosiltranferase activity, which might determine its participation in the modification of host proteins when translocated to the cytoplasm of eukaryotic cells. In the context of host-bacteria communication, these results provide insight into the adaptation mechanisms that allow some pathogenic and/or probiotic E. coli strains to adapt more effectively to the intestinal environment than bacteria lacking these mechanisms.

[EN] Mutants able to germinate and perform early growth in medium containing a high NaCl concentration were identified and named salt resistant (sre). The sre mutants also were able to germinate in high-osmoticum medium, indicating that they are osmotolerant in a germination assay. Complementation analyses revealed that sre1-1 and sre1-2 were alleles of the abscisic acid (ABA) biosynthesis ABA2 gene. A map-based cloning strategy allowed the identification of the ABA2 gene and molecular characterization of the new aba2 alleles. The ABA2 gene product belongs to the family of short-chain dehydrogenases/reductases, which are known to be NAD- or NADP-dependent oxidoreductases. Recombinant ABA2 protein produced in Escherichia coli exhibits a Km value for xanthoxin of 19 µM and catalyzes in a NAD-dependent manner the conversion of xanthoxin to abscisic aldehyde, as determined by HPLC-mass spectrometry. The ABA2 mRNA is expressed constitutively in all plant organs examined and is not upregulated in response to osmotic stress. The results of this work are discussed in the context of previous genetic and biochemical evidence regarding ABA biosynthesis, confirming the xanthoxin-->abscisic aldehyde-->ABA transition as the last steps of the major ABA biosynthetic pathway. The abscisic aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product of A. thaliana catalyzes the final step in abscisic acid (ABA) biosynthesis. An aao3-1 mutant in a Landsberg erecta genetic background exhibited a wilty phenotype in rosette leaves, whereas seed dormancy was not affected (Seo et al., 2000a). Therefore, it was speculated that a different aldehyde oxidase would be the major contributor to ABA biosynthesis in seeds (Seo et al., 2000a). Through a screening based on germination under high-salt concentration, we isolated two mutants in a Columbia genetic background, initially named sre2-1 and sre2-2. Complementation tests with different ABA-deficient mutants indicated that sre2-1 and sre2- 2 mutants were allelic to aao3-1, and therefore they were renamed as aao3-2 and aao3-3, respectively. Indeed, molecular characterization of the aao3-2 mutant revealed a T-DNA insertional mutation that abolished the transcription of AAO3 gene, while sequence analysis of AAO3 in aao3-3 mutant revealed a deletion of three nucleotides and several missense mutations. Physiological characterization of aao3-2 and aao3-3 mutants revealed a wilty phenotype and osmotolerance in germination assays. In contrast to aao3-1, both aao3-2 and aao3-3 mutants showed a reduced dormancy. Accordingly, ABA levels were reduced in dry seeds and rosette leaves of both aao3-2 and aao3-3. Taken together, these results indicate that AAO3 gene product plays a major role in seed ABA biosynthesis. / [ES] El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona implicada en el control de procesos vegetales esenciales, principalmente el desarrollo de la semilla así como la respuesta de las plantas a diferentes estreses ambientales, particularmente frío, sequía y salinidad. En el presente trabajo se ha realizado la búsqueda en colecciones de Arabidopsis thaliana mutagenizadas con T-DNA de mutantes capaces de germinar en condiciones de alta sal (NaCl), identificándose tres loci mutantes, inicialmente denominados sre1, sre2 y sre3 (“salt resistant”). Los mutantes sre, además de su capacidad para germinar y establecer plántula en condiciones de estrés osmótico, mostraban una germinación resistente a paclobutrazol, latencia muy reducida, mayor transpiración y niveles de ABA en hojas de roseta significativamente menores que plantas silvestres. El análisis de complementación reveló que los mutantes sre1 eran alélicos al mutante aba2-1, los mutante sre2 eran alélicos al mutante aao3-1 y el mutante sre3 era alélico al mutante aba1-5. Así, el ABA bloquea la germinación y el establecimiento de la plántula en condiciones de bajo potencial hídrico, por lo que mutantes capaces de germinar en condiciones de estrés osmótico representan frecuentemente mutantes defectivos en la biosíntesis de ABA. Mediante una combinación de las estrategias de mapeo posicional y gen candidato se llevó a cabo la identificación del gen ABA2 y de las mutaciones sre1-1/aba2-11 y sre1- 2/aba2-12. El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena corta dependiente de NAD+ (SDR). La mutación sre1-1/aba2-11 es debida a una deleción de 53 pb que también supone un cambio en la pauta de lectura, generando un alelo nulo de ABA2. La mutación sre1-2/aba2-12 conduce a la sustitución Gly28Arg, afectando al sitio de unión del coenzima. Mediante un análisis HPLC-MS se ha demostrado que la proteína recombinante ABA2 cataliza la conversión de xantoxina en aldehído abscísico en una reacción dependiente de NAD+ . Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen inequívocamente que la conversión de xantoxina en aldehído abscísico representa el penúltimo paso de la ruta de biosíntesis de ABA y que este es catalizado por el producto génico del gen ABA2 (At1g52340). El último paso de la ruta de biosíntesis de ABA es la conversión de aldehído abscísico en ácido abscísico. Este paso está catalizado en Arabidopsis por el producto génico del gen AAO3. Los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutante aao3-1, muestran una reducción en los niveles de ABA en hojas de roseta y una mayor transpiración que las plantas silvestres. Además, y contrariamente el mutante aao3-1, muestran un fenotipo de osmotolerancia en germinación y establecimiento de plántula, germinación resistente a paclobutrazol, latencia reducida y poseen una reducción del 65% en los niveles de ABA en semillas. La caracterización molecular de la mutación sre2-1/aao3-2 revela una inserción de T-DNA que elimina la transcripción del gen AAO3, constituyendo por tanto un alelo nulo. La secuenciación del gen AAO3 en el mutante sre2-2/aao3-3 revela una deleción de tres nucleótidos y varias mutaciones de cambio de sentido. La evidencia genética y bioquímica resultante del análisis de los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aaao3-3 indica que lesiones en el gen AAO3 conducen a niveles reducidos de ABA y fenotipos característicos en semillas. Por consiguiente, queda demostrado que el gen AAO3 desempeña un papel crucial en la biosíntesis de ABA en semillas. / [CA] L´àcid abscísic (ABA) és una fitohormona que ha estat implicada en el control de processos vegetals essencials, principalment en el desenvolupament de la llavor així com en la resposta de les plantes a diferents estressos ambientals, particularment fred, sequera i salinitat. En el present treball de tesi doctoral s´ha fet la recerca en coleccions d´Arabidopsis thaliana mutagenizades amb T-DNA de mutants capaços de germinar en condicions d´elevada sal (NaCl), identificant-se tres loci mutants, inicialment denominats sre1,sre2 i sre3 (“salt resistant”). Els mutants sre, a més de la seva capacitat per a germinar i establir plàntula en condicions d´estrès osmòtic, mostraven una germinació resistent a paclobutrazol, latència molt reduïda, major transpiració i nivells d´ABA en fulles de roseta significativament menors que les plantes silvestres. L´anàlisi de complementació va mostrar que els mutants sre1 eren al·lèlics al mutant aba2-1, els mutants sre2 eren al·lèlics al mutant aao3-1 i el mutant sre3 era al·lèlic al mutant aba1-5. Així, l´ABA bloqueja la germinació i l´establiment de la plàntula en condicions de baix potencial hídric, i aleshores mutants capaços de germinar en condicions d´estrès osmòtic representen normalment mutants amb defectes en la biosíntesi d´ABA. Mitjançant una combinació de les estratègies de mapeig posicional i gen candidat s´ha realitzat la identificació del gen ABA2 y de les mutacions sre1-1/aba2- 11 y sre1-2/aba2-12.El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena curta dependent de NAD+ (SDR). La mutació sre1-1/aba2-11 es deguda a una deleció de 53 pb que també suposa un camvi en la pauta de lectura, generant un al·lel nul de ABA2. La mutació sre1-2/aba2-12 produeix a la substitució Gly28Arg, afectant al lloc d´unió del coenzima. Mitjançant un anàlisi HPLC-MS s´ha demostrat que la proteïna recombinant ABA2 catalitza la conversió de xantoxina en aldehid abscísic en una reacció dependent de NAD+ . Els resultats obtinguts en el present treball estableixen inequívocament que la conversió de xantoxina en aldehíd abscísic representa el penúltim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA i que està catalitzat pel producte gènic del gen ABA2 (At1g52340). L´últim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA és la conversió de l´aldehid abscísic en àcid abscísic. Aquest pas està catalitzat en A. thaliana pel producte gènic del gen AAO3. Els mutants sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutant aao3-1, mostraven una reducció en els nivells d´ABA en fulles de roseta i una major transpiració que las plantes silvestres. A més, i contràriament al mutant aao3-1, mostraven un fenotip de osmotolerancia en germinació i establiment de plàntula, germinació resistent a paclobutrazol, latència reduïda i posseeixen una reducció del 65% en els nivells d´ABA en llavors. La caracterització molecular de la mutació sre2-1/aao3-2 revela una inserció de T-DNA que elimina la transcripció del gen AAO3, constituint por tant un al·lel nul. La secuenciació del gen AAO3 en el mutant sre2-2/aao3-3 va revelar una deleció de tres nucleòtids i vàries mutacions de canvi de sentit. L´evidencia genètica i bioquímica resultant de l´anàlisi dels mutants sre2- 1/aao3-2 i sre2-2/aaao3-3 indica que lesions en el gen AAO3 condueixen a nivells reduïts d´ABA i fenotips característics en llavors. Aleshores, queda demostrat que el gen AAO3 poseeix un paper crucial en la biosíntesi d´ABA en llavors. / González Guzmán, M. (2005). Genética molecular de la biosíntesis del ácido abscísico. Clonación y caracterización del gen ABA2 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/135830 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de optimizar la técnica y probar su eficiencia en distintas dianas se modificaron dos genes implicados en LMA. Estos fueron el gen IDH2, en el cuál se buscó introducir la mutación R172, y el gen MYBL2. Finalmente, las eficiencias de edición obtenidas se compararon con el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR, muy utilizados por su alta eficiencia. Mientras que los complejos de ribonucleoproteínas presentaron una mayor eficiencia de corte, la eficiencia de edición de la mutación R172 fue similar en ambas estrategias. Mediante secuenciación masiva se confirmó y caracterizó esta edición y se comprobó que la maquinaria de edición no había producido cortes inespecíficos en regiones similares del genoma. Por tanto, la nueva metodología desarrollada permitió editar de forma precisa líneas celulares leucémicas con eficiencias similares a otras técnicas CRISPR más extendidas y sin producir efectos inespecíficos no deseados. Por otro lado, gracias a la gran conservación evolutiva del gen IDH2, los residuos R140 y R172 se encuentran conservados en la proteína idh-2 de Caenorhabditis elegans. Se empleó la estrategia co-CRISPR para desarrollar y seleccionar cepas mutantes con las mutaciones ortólogas a R140 y R172, y una cepa con ambas mutaciones. A pesar de la conservación, no se observó el aumento del oncometabolito 2-HG esperado en las cepas mutantes en comparación con la cepa salvaje control N2. Un estudio exhaustivo de las vías implicadas nos serviría para desarrollar modelos de investigación con las alteraciones moleculares observadas en los pacientes. Para concluir, la estrategia desarrollada de introducción de elementos CRISPR en líneas celulares, junto a los modelos producidos en C. elegans, permitirán en futuros estudios investigar en detalle los efectos moleculares de mutaciones detectadas en pacientes de LMA, su implicación en el desarrollo y pronóstico de la LMA y comprender su papel en la estratificación de los pacientes. / [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i provar la seua eficiència en diferents dianes es van modificar dos gens implicats en LMA. Aquests van ser el gen IDH2, en el qual es va buscar introduir la mutació R172, i el gen MYBL2. Finalment, les eficiències d'edició obtingudes amb la nova estratègia es van comparar amb l'ús de complexos ribonucleotproteïnes CRISPR, molt utilitzats per la seua alta eficiència. Mentre que els complexos de ribonucleoproteïnes van presentar una major eficiència de tall, l'eficiència d'edició de la mutació R172 va ser similar en les dues estratègies. Mitjançant seqüenciació massiva es va confirmar i caracteritzar aquesta edició i es va comprovar que la maquinària d'edició no havia produït talls inespecífics en regions similars del genoma. D'aquesta manera, la nova metodologia desenvolupada permet editar de manera precisa línies cel·lulars leucèmiques amb eficiències similars a altres tècniques CRISPR més esteses i sense produir efectes inespecífics no desitjats. D'altra banda, gràcies a la gran conservació evolutiva del gen IDH2, els residus R140 i R172 es troben conservats en la proteïna idh-2 de Caenorhabditis elegans. Es va utilitzar l'estratègia co-CRISPR per a desenvolupar i seleccionar ceps mutants amb les mutacions ortòlogues a R140 i R172, i un cep amb dues mutacions. Malgrat l'alta conservació, no es va observar l'augment del oncometabolit 2-HG esperat en els ceps mutants en comparació amb el cep salvatge control N2. Un estudi exhaustiu de les vies implicades ens serviria per a desenvolupar models d'investigació amb les alteracions moleculars observades en els pacients. Per a concloure, l'estratègia desenvolupada d'introducció d'elements CRISPR en línies cel·lulars, al costat dels models produïts en C. elegans permetran en estudis futurs investigar detalladament els efectes moleculars de mutacions detectades en pacients, la seua implicació en el desenvolupament i prognosi de la LMA i comprendre el seu paper en l'estratificació dels pacients. / [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with the new strategy were compared with CRISPR ribonucleoproteins methodology, widely used for its high efficiency. Whereas ribonucleoprotein complexes showed higher cut efficiencies, the efficiency of edition of R172 mutation efficiency was similar in both strategies. These results were validated and characterized by means of next generation sequencing, and no off-target effects were found. Therefore, the new developed methodology allows precise gene editing in leukemic cell lines with similar efficiencies with other popular CRISPR techniques and without off-target effects. On the other hand, thanks to the high evolutive conservation of IDH2 gene R140 and R172 residues are conserved in Caenorhabditis elegans idh-2 protein. The co-CRISPR strategy was used to produce and select mutant strains with ortholog mutations to R140, R172 and one strain with both mutations. Despite the high conservation, the expected increase in oncometabolite 2-HG concentration was not detected in mutant strains compared to the N2 wild type strain. A comprehensive study of the pathways involved would help us to develop a research model with molecular alterations noticed in patients. In conclusion, the new developed strategy for CRISPR elements introduction in cell lines, together with C. elegans models, will allow an in-depth research of molecular effect of mutations detected in patients, its implication in AML progression and prognosis and understand their role in patient stratification. / González Romero, E. (2022). Investigación de la Leucemia Mieloide Aguda mediante el desarrollo de modelos in vitro e in vivo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181891 / TESIS